304 துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய் இரசாயன கூறு, SPACA6 எக்டோடோமைனின் கட்டமைப்பானது கேமட் ஃப்யூசனுடன் தொடர்புடைய புரதங்களின் பாதுகாக்கப்பட்ட சூப்பர் குடும்பத்தைக் கொண்டுள்ளது.

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரு ஸ்லைடிற்கு மூன்று கட்டுரைகளைக் காட்டும் ஸ்லைடர்கள்.ஸ்லைடுகளின் வழியாக செல்ல பின் மற்றும் அடுத்த பட்டன்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒவ்வொரு ஸ்லைடையும் நகர்த்த இறுதியில் ஸ்லைடு கன்ட்ரோலர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.

SPACA6 என்பது விந்தணு-வெளிப்படுத்தப்பட்ட மேற்பரப்பு புரதமாகும், இது பாலூட்டிகளின் பாலியல் இனப்பெருக்கத்தின் போது கேமட் இணைவுக்கு முக்கியமானது.இந்த அடிப்படை பங்கு இருந்தபோதிலும், SPACA6 இன் குறிப்பிட்ட செயல்பாடு சரியாக புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனின் படிக அமைப்பை 2.2 Å தெளிவுத்திறனில் நாங்கள் தெளிவுபடுத்துகிறோம், இது நான்கு-இழைகள் கொண்ட மூட்டை மற்றும் Ig-போன்ற β-சாண்ட்விச்களை அரை-நெகிழ்வான இணைப்பாளர்களால் இணைக்கப்பட்ட இரண்டு-டொமைன் புரதத்தை வெளிப்படுத்துகிறது.இந்த அமைப்பு IZUMO1, மற்றொரு கேமட் ஃப்யூஷன்-தொடர்புடைய புரதத்தை ஒத்திருக்கிறது, SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஐஎஸ்டி சூப்பர்ஃபாமிலி என குறிப்பிடப்படும் கருத்தரித்தல்-தொடர்புடைய புரதங்களின் சூப்பர் குடும்பத்தின் நிறுவன உறுப்பினர்களை உருவாக்குகிறது.IST சூப்பர் குடும்பம் அதன் முறுக்கப்பட்ட நான்கு-ஹெலிக்ஸ் மூட்டை மற்றும் ஒரு ஜோடி டிஸல்பைட்-இணைக்கப்பட்ட CXXC மையக்கருத்துகளால் கட்டமைப்பு ரீதியாக வரையறுக்கப்படுகிறது.மனித புரதத்தின் கட்டமைப்பு அடிப்படையிலான ஆல்பாஃபோல்ட் தேடல் இந்த சூப்பர் குடும்பத்தின் கூடுதல் புரத உறுப்பினர்களை அடையாளம் கண்டுள்ளது;குறிப்பாக, இந்த புரதங்களில் பல கேமட் இணைவில் ஈடுபட்டுள்ளன.SPACA6 அமைப்பும் IST சூப்பர் குடும்பத்தின் மற்ற உறுப்பினர்களுடனான அதன் உறவும் பாலூட்டிகளின் கேமட் இணைவு பற்றிய நமது அறிவில் விடுபட்ட இணைப்பை வழங்குகிறது.
ஒவ்வொரு மனித வாழ்க்கையும் இரண்டு தனித்தனி ஹாப்ளாய்டு கேமட்களுடன் தொடங்குகிறது: தந்தையின் விந்து மற்றும் தாயின் முட்டை.இந்த விந்தணு ஒரு தீவிர தேர்வு செயல்முறையின் வெற்றியாளராக உள்ளது, இதன் போது மில்லியன் கணக்கான விந்து செல்கள் பெண் பிறப்புறுப்பு பாதை வழியாக கடந்து, பல்வேறு தடைகளை கடந்து மற்றும் கொள்ளளவிற்கு உட்படுகின்றன, இது அவற்றின் இயக்கம் மற்றும் மேற்பரப்பு கூறுகளின் செயல்முறையை மேம்படுத்துகிறது.விந்தணுவும் ஓசைட்டும் ஒன்றையொன்று கண்டுபிடித்தாலும், செயல்முறை இன்னும் முடிவடையவில்லை.ஓசைட் குமுலஸ் செல்கள் மற்றும் ஜோனா பெல்லுசிடா எனப்படும் கிளைகோபுரோட்டீன் தடையால் சூழப்பட்டுள்ளது, இதன் மூலம் விந்தணுக்கள் ஓசைட்டுக்குள் நுழைய வேண்டும்.இந்த இறுதி தடைகளை கடக்க, மேற்பரப்பு ஒட்டுதல் மூலக்கூறுகள் மற்றும் சவ்வு-தொடர்புடைய மற்றும் சுரக்கும் நொதிகளின் கலவையை விந்தணுக்கள் பயன்படுத்துகின்றன.இந்த மூலக்கூறுகள் மற்றும் என்சைம்கள் முக்கியமாக உள் சவ்வு மற்றும் அக்ரோசோமல் மேட்ரிக்ஸில் சேமிக்கப்படுகின்றன மற்றும் விந்தணுவின் வெளிப்புற சவ்வு அக்ரோசோமல் எதிர்வினையின் போது லைஸ் செய்யப்படும்போது கண்டறியப்படுகின்றன.இந்த தீவிரப் பயணத்தின் இறுதிப் படியானது விந்தணு-முட்டை இணைவு நிகழ்வாகும், இதில் இரண்டு செல்கள் அவற்றின் சவ்வுகளை இணைத்து ஒற்றை இருமுனை உயிரினமாக மாறுகின்றன7.இந்த செயல்முறை மனித இனப்பெருக்கத்தில் அற்புதமானது என்றாலும், தேவையான மூலக்கூறு இடைவினைகள் சரியாக புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.
கேமட்களின் கருத்தரிப்புக்கு கூடுதலாக, இரண்டு லிப்பிட் பைலேயர்களின் இணைவின் வேதியியல் விரிவாக ஆய்வு செய்யப்பட்டுள்ளது.பொதுவாக, சவ்வு இணைவு என்பது ஆற்றல் மிக்க சாதகமற்ற செயல்முறையாகும், இது இரண்டு சவ்வுகளை நெருக்கமாக கொண்டு, அவற்றின் தொடர்ச்சியை உடைத்து, இணைவை ஏற்படுத்தும் ஒரு கட்டமைப்பு மாற்றத்திற்கு புரத வினையூக்கி தேவைப்படுகிறது.இந்த புரத வினையூக்கிகள் ஃபுசோஜென்கள் என்று அழைக்கப்படுகின்றன மற்றும் எண்ணற்ற இணைவு அமைப்புகளில் காணப்படுகின்றன.ஹோஸ்ட் செல்களில் வைரஸ் நுழைவதற்கு அவை தேவைப்படுகின்றன (எ.கா., எச்.ஐ.வி-1 இல் gp160, கொரோனா வைரஸ்களில் ஸ்பைக், இன்ஃப்ளூயன்ஸா வைரஸ்களில் ஹெமாக்ளூட்டின்)10,11,12 நஞ்சுக்கொடி (சின்சிடின்)13,14,15 மற்றும் குறைந்த யூகாரியோட்களில் கேமட்-உருவாக்கும் இணைவுகள் ( HAP2/GCS1 தாவரங்கள், புரோட்டிஸ்ட்கள் மற்றும் ஆர்த்ரோபாட்களில்) 16,17,18,19.மனித கேமட்களுக்கான ஃபுசோஜென்கள் இன்னும் கண்டுபிடிக்கப்படவில்லை, இருப்பினும் பல புரதங்கள் கேமட் இணைப்பு மற்றும் இணைவுக்கு முக்கியமானதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது.ஓசைட்-வெளிப்படுத்தப்பட்ட சிடி9, சுட்டி மற்றும் மனித கேமட்களின் இணைவுக்குத் தேவையான டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் புரதம், 21,22,23 முதல் கண்டுபிடிக்கப்பட்டது.அதன் துல்லியமான செயல்பாடு தெளிவாக இல்லை என்றாலும், ஒட்டுதலில் ஒரு பங்கு, முட்டை மைக்ரோவில்லி மீது ஒட்டுதல் குவியத்தின் அமைப்பு மற்றும்/அல்லது ஓசைட் மேற்பரப்பு புரதங்களின் சரியான உள்ளூர்மயமாக்கல் 24,25,26 என்று தெரிகிறது.கேமட் இணைவுக்கு முக்கியமான இரண்டு மிகவும் பொதுவான புரதங்கள் விந்தணு புரதம் IZUMO127 மற்றும் ஓசைட் புரதம் JUNO28 ஆகும், மேலும் அவற்றின் பரஸ்பர தொடர்பு இணைப்பிற்கு முன் கேமட் அங்கீகாரம் மற்றும் ஒட்டுதலில் ஒரு முக்கியமான படியாகும்.ஆண் Izumo1 நாக் அவுட் எலிகள் மற்றும் பெண் ஜூனோ நாக் அவுட் எலிகள் முற்றிலும் மலட்டுத்தன்மை கொண்டவை, இந்த மாதிரிகளில் விந்தணுக்கள் perivitelline விண்வெளியில் நுழைகின்றன, ஆனால் கேமட்கள் இணைவதில்லை.இதேபோல், மனிதனின் சோதனைக் கருத்தரித்தல் பரிசோதனைகளில் கேமட்களை ஆன்டி-IZUMO1 அல்லது JUNO27,29 ஆன்டிபாடிகள் மூலம் சிகிச்சையளிக்கும்போது சங்கமம் குறைக்கப்பட்டது.
சமீபத்தில், IZUMO1 மற்றும் JUNO20,30,31,32,33,34,35 போன்ற பினோடிபிகலாக விந்தணு-வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களின் குழு புதிதாக கண்டுபிடிக்கப்பட்டது.விந்தணு அக்ரோசோமால் சவ்வு-தொடர்புடைய புரதம் 6 (SPACA6) பெரிய அளவிலான முரைன் பிறழ்வு ஆய்வில் கருத்தரிப்பதற்கு அவசியமானது என அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது.ஸ்பாகா6 மரபணுவில் டிரான்ஸ்ஜீனைச் செருகுவது உருக முடியாத விந்தணுவை உருவாக்குகிறது, இருப்பினும் இந்த விந்தணுக்கள் பெரிவிடலைன் இடைவெளியில் ஊடுருவுகின்றன.எலிகளில் அடுத்தடுத்த நாக் அவுட் ஆய்வுகள் கேமட் ஃப்யூஷன் 30,32 க்கு ஸ்பாகா6 தேவை என்பதை உறுதிப்படுத்தியது.SPACA6 விரைகளில் பிரத்தியேகமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் IZUMO1 போன்ற ஒரு உள்ளூர்மயமாக்கல் வடிவத்தைக் கொண்டுள்ளது, அதாவது அக்ரோசோமால் எதிர்வினைக்கு முன் விந்தணுவின் உள்ளுறுப்புக்குள், பின்னர் அக்ரோசோமல் எதிர்வினை 30,32 க்குப் பிறகு பூமத்திய ரேகை பகுதிக்கு இடம்பெயர்கிறது.Spaca6 ஹோமோலாக்ஸ்கள் பல்வேறு பாலூட்டிகள் மற்றும் பிற யூகாரியோட்டுகளில் உள்ளன [30] மற்றும் மனித கேமட் இணைவுக்கான அதன் முக்கியத்துவம் SPACA6 30 க்கு எதிர்ப்பின் மூலம் விட்ரோவில் மனித கருத்தரிப்பைத் தடுப்பதன் மூலம் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.IZUMO1 மற்றும் JUNO போலல்லாமல், SPACA6 இன் கட்டமைப்பு, தொடர்புகள் மற்றும் செயல்பாடு பற்றிய விவரங்கள் தெளிவாக இல்லை.
குடும்பக் கட்டுப்பாடு மற்றும் கருவுறுதல் சிகிச்சையில் எதிர்கால முன்னேற்றங்களைத் தெரிவிக்க உதவும் மனித விந்து மற்றும் முட்டைகளின் இணைவின் அடிப்படையிலான அடிப்படை செயல்முறையை நன்கு புரிந்து கொள்ள, SPACA6 கட்டமைப்பு மற்றும் உயிர்வேதியியல் ஆய்வுகளை நடத்தினோம்.SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனின் படிக அமைப்பு நான்கு ஹெலிகல் மூட்டை (4HB) மற்றும் அரை-நெகிழ்வான பகுதிகளால் இணைக்கப்பட்ட இம்யூனோகுளோபுலின் போன்ற (Ig-போன்ற) டொமைனைக் காட்டுகிறது.முந்தைய ஆய்வுகளில் கணித்தபடி, 7,32,37 SPACA6 இன் டொமைன் அமைப்பு மனித IZUMO1 ஐப் போன்றது, மேலும் இரண்டு புரதங்களும் ஒரு அசாதாரண மையக்கருத்தைப் பகிர்ந்து கொள்கின்றன: 4HB முக்கோண ஹெலிகல் மேற்பரப்பு மற்றும் ஒரு ஜோடி டிஸல்பைடு-இணைக்கப்பட்ட CXXC மையக்கருத்துக்கள்.IZUMO1 மற்றும் SPACA6 ஆகியவை இப்போது கேமட் ஃப்யூசனுடன் தொடர்புடைய புரதங்களின் பெரிய, கட்டமைப்பு ரீதியாக தொடர்புடைய சூப்பர் குடும்பத்தை வரையறுக்கின்றன என்று நாங்கள் முன்மொழிகிறோம்.சூப்பர் ஃபேமிலிக்கு தனித்துவமான அம்சங்களைப் பயன்படுத்தி, ஆல்பாஃபோல்ட் கட்டமைப்பு மனித புரதத்திற்கான முழுமையான தேடலை நாங்கள் மேற்கொண்டோம், இந்த சூப்பர் குடும்பத்தின் கூடுதல் உறுப்பினர்களை அடையாளம் கண்டோம், இதில் கேமட் இணைவு மற்றும்/அல்லது கருத்தரிப்பில் ஈடுபட்டுள்ள பல உறுப்பினர்கள் உள்ளனர்.கேமட் இணைவுடன் தொடர்புடைய புரதங்களின் பொதுவான கட்டமைப்பு மடிப்பு மற்றும் சூப்பர் குடும்பம் இருப்பதாக இப்போது தோன்றுகிறது, மேலும் மனித கேமட் இணைவு பொறிமுறையின் இந்த முக்கிய அம்சத்தின் மூலக்கூறு வரைபடத்தை எங்கள் அமைப்பு வழங்குகிறது.
SPACA6 என்பது ஒரு N-இணைக்கப்பட்ட கிளைக்கான் மற்றும் ஆறு புட்டேட்டிவ் டைசல்பைட் பிணைப்புகளைக் கொண்ட ஒரு ஒற்றை-பாஸ் டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் புரதமாகும் (புள்ளிவிவரங்கள் S1a மற்றும் S2).டிரோசோபிலா S2 செல்களில் மனித SPACA6 (எச்சங்கள் 27-246) இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனை வெளிப்படுத்தினோம் மற்றும் நிக்கல் தொடர்பு, கேஷன் பரிமாற்றம் மற்றும் அளவு விலக்கு நிறமூர்த்தம் (படம். S1b) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி புரதத்தைச் சுத்தப்படுத்தினோம்.சுத்திகரிக்கப்பட்ட SPACA6 எக்டோடோமைன் மிகவும் நிலையானது மற்றும் ஒரே மாதிரியானது.பலகோண ஒளி சிதறல் (SEC-MALS) உடன் இணைந்து அளவு விலக்கு நிறமூர்த்தத்தைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு 26.2 ± 0.5 kDa (படம். S1c) என்ற கணக்கிடப்பட்ட மூலக்கூறு எடையுடன் ஒரு உச்சத்தை வெளிப்படுத்தியது.இது SPACA6 மோனோமெரிக் எக்டோடோமைனின் அளவோடு ஒத்துப்போகிறது, இது சுத்திகரிப்பு போது ஒலிகோமரைசேஷன் ஏற்படவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.கூடுதலாக, வட்ட டைக்ரோயிசம் (சிடி) ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி 51.3 டிகிரி செல்சியஸ் உருகும் புள்ளியுடன் (படம். எஸ் 1 டி, இ) ஒரு கலப்பு α/β அமைப்பை வெளிப்படுத்தியது.குறுவட்டு நிறமாலையின் டிகான்வல்யூஷன் 38.6% α-ஹெலிகல் மற்றும் 15.8% β-ஸ்ட்ராண்டட் தனிமங்களை வெளிப்படுத்தியது (படம் S1d).
SPACA6 எக்டோடோமைன் ரேண்டம் மேட்ரிக்ஸ் சீடிங்38 ஐப் பயன்படுத்தி படிகமாக்கப்பட்டது, இதன் விளைவாக 2.2 Å (அட்டவணை 1 மற்றும் படம் S3) தெளிவுத்திறனுடன் தரவு அமைக்கப்பட்டது.கட்டமைப்பைத் தீர்மானிப்பதற்கான புரோமைடு வெளிப்பாட்டுடன் துண்டு-அடிப்படையிலான மூலக்கூறு மாற்றீடு மற்றும் SAD கட்ட தரவு ஆகியவற்றின் கலவையைப் பயன்படுத்தி (அட்டவணை 1 மற்றும் படம் S4), இறுதி சுத்திகரிக்கப்பட்ட மாதிரியானது 27-246 எச்சங்களைக் கொண்டுள்ளது.கட்டமைப்பு தீர்மானிக்கப்பட்ட நேரத்தில், சோதனை அல்லது ஆல்பாஃபோல்ட் கட்டமைப்புகள் எதுவும் கிடைக்கவில்லை.SPACA6 எக்டோடோமைன் 20 Å × 20 Å × 85 Å அளவைக் கொண்டுள்ளது, ஏழு ஹெலிகள் மற்றும் ஒன்பது β-ஸ்ட்ராண்ட்களைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் ஆறு டிஸல்பைடு பிணைப்புகளால் உறுதிப்படுத்தப்பட்ட ஒரு நீளமான மூன்றாம் நிலை மடிப்பு உள்ளது (படம். 1a, b).Asn243 பக்கச் சங்கிலியின் முடிவில் பலவீனமான எலக்ட்ரான் அடர்த்தி இந்த எச்சம் ஒரு N-இணைக்கப்பட்ட கிளைகோசைலேஷன் என்பதைக் குறிக்கிறது.கட்டமைப்பு இரண்டு டொமைன்களைக் கொண்டுள்ளது: ஒரு N-டெர்மினல் நான்கு-ஹெலிக்ஸ் பண்டில் (4HB) மற்றும் ஒரு C-டெர்மினல் Ig-போன்ற டொமைன் அவற்றுக்கிடையே ஒரு இடைநிலை கீல் பகுதியுடன் (படம் 1c).
SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனின் கட்டமைப்பு.SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனின் துண்டு வரைபடம், N இலிருந்து C-டெர்மினஸ் வரை அடர் நீலம் முதல் அடர் சிவப்பு வரை சங்கிலியின் நிறம்.டைசல்பைட் பிணைப்புகளில் ஈடுபடும் சிஸ்டைன்கள் மெஜந்தாவில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன.b SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனின் இடவியல்.படம் 1a இல் உள்ள அதே வண்ணத் திட்டத்தைப் பயன்படுத்தவும்.c SPACA6 எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைன்.4HB, கீல் மற்றும் Ig போன்ற டொமைன் பட்டை விளக்கப்படங்கள் முறையே ஆரஞ்சு, பச்சை மற்றும் நீல நிறத்தில் உள்ளன.அடுக்குகள் அளவிற்கு வரையப்படவில்லை.
SPACA6 இன் 4HB டொமைனில் நான்கு முக்கிய ஹெலிகள் (ஹெலிஸ்கள் 1-4) அடங்கும், அவை ஹெலிகல் ஹெலிக்ஸ் (படம் 2a) வடிவில் அமைக்கப்பட்டிருக்கும், அவை எதிர்பாரலல் மற்றும் இணையான இடைவினைகளுக்கு இடையில் மாறி மாறி வருகின்றன (படம். 2b).ஒரு சிறிய கூடுதல் ஒற்றை-திருப்ப ஹெலிக்ஸ் (ஹெலிக்ஸ் 1′) மூட்டைக்கு செங்குத்தாக அமைக்கப்பட்டு, ஹெலிகள் 1 மற்றும் 2 உடன் ஒரு முக்கோணத்தை உருவாக்குகிறது. இந்த முக்கோணம், ஹெலிக்ஸ் 3 மற்றும் 4 (ஹெலிக்ஸ்) ஒப்பீட்டளவில் அடர்த்தியான பேக்கிங்கின் ஹெலிகல்-டுவிஸ்ட் பேக்கிங்கில் சிறிது சிதைந்துள்ளது ( படம் 2a).
4HB N-டெர்மினல் துண்டு விளக்கப்படம்.b நான்கு ஹெலிகள் கொண்ட மூட்டையின் மேல் காட்சி, ஒவ்வொரு ஹெலிக்ஸும் N-டெர்மினஸில் அடர் நீலத்திலும், C-டெர்மினஸில் அடர் சிவப்பு நிறத்திலும் சிறப்பிக்கப்பட்டுள்ளது.c 4HBக்கான மேல்-கீழ் சுழல் சக்கர வரைபடம், ஒவ்வொரு எச்சமும் ஒரு ஒற்றை எழுத்து அமினோ அமிலக் குறியீட்டைக் கொண்ட வட்டமாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது;சக்கரத்தின் மேற்புறத்தில் உள்ள நான்கு அமினோ அமிலங்கள் மட்டுமே எண்ணப்பட்டுள்ளன.துருவமற்ற எச்சங்கள் மஞ்சள் நிறத்திலும், துருவ சார்ஜ் செய்யப்படாத எச்சங்கள் பச்சை நிறத்திலும், நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்கள் நீல நிறத்திலும், எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்கள் சிவப்பு நிறத்திலும் இருக்கும்.d 4HB டொமைனின் முக்கோண முகங்கள், 4HBகள் ஆரஞ்சு நிறத்திலும் கீல்கள் பச்சை நிறத்திலும் உள்ளன.இரண்டு இன்செட்டுகளும் தடி வடிவ டிஸல்பைட் பிணைப்புகளைக் காட்டுகின்றன.
4HB முக்கியமாக அலிபாடிக் மற்றும் நறுமண எச்சங்கள் (படம். 2c) கொண்ட உள் ஹைட்ரோபோபிக் மையத்தில் குவிந்துள்ளது.மையமானது Cys41 மற்றும் Cys55 க்கு இடையில் ஒரு டைசல்பைட் பிணைப்பைக் கொண்டுள்ளது, இது ஹெலிகள் 1 மற்றும் 2 ஐ மேல் உயர்த்தப்பட்ட முக்கோணத்தில் இணைக்கிறது (படம் 2d).ஹெலிக்ஸ் 1′ இல் உள்ள CXXC மையக்கருத்திற்கும் கீல் பகுதியில் உள்ள β-ஹேர்பின் முனையில் காணப்படும் மற்றொரு CXXC மையக்கருத்திற்கும் இடையே இரண்டு கூடுதல் டிஸல்பைட் பிணைப்புகள் உருவாக்கப்பட்டன (படம். 2d).அறியப்படாத செயல்பாடு (Arg37) கொண்ட ஒரு பழமைவாத அர்ஜினைன் எச்சம் 1′, 1 மற்றும் 2 ஹெலிகளால் உருவாக்கப்பட்ட ஒரு வெற்று முக்கோணத்திற்குள் அமைந்துள்ளது. அலிபாடிக் கார்பன் அணுக்கள் Cβ, Cγ மற்றும் Cδ Arg37 ஹைட்ரோபோபிக் மையத்துடன் தொடர்பு கொள்கின்றன, மேலும் அதன் குவானிடைன் குழுக்களை சுழற்சி முறையில் நகர்த்துகிறது. ஹெலிகள் 1′ மற்றும் 1 இடையே Thr32 முதுகெலும்பு மற்றும் பக்க சங்கிலி (படம். S5a,b) இடையேயான இடைவினைகள் மூலம்.Tyr34 இரண்டு சிறிய துவாரங்களை விட்டு குழிக்குள் நீண்டுள்ளது, இதன் மூலம் Arg37 கரைப்பானுடன் தொடர்பு கொள்ள முடியும்.
Ig-போன்ற β-சாண்ட்விச் டொமைன்கள், இரண்டு அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட மல்டி-ஸ்ட்ரான்டட் ஆம்பிபாடிக் β-தாள்களின் பொதுவான அம்சத்தைப் பகிர்ந்து கொள்ளும் புரதங்களின் ஒரு பெரிய சூப்பர் குடும்பமாகும், அவை ஹைட்ரோபோபிக் கோர் 39 வழியாக தொடர்பு கொள்கின்றன. மற்றும் இரண்டு அடுக்குகளைக் கொண்டுள்ளது (படம். S6a).தாள் 1 என்பது நான்கு இழைகளின் (டி, எஃப், எச், மற்றும் ஐ இழைகள்) β-தாள் ஆகும், இதில் இழைகள் எஃப், எச் மற்றும் ஐ ஆகியவை இணை-எதிர்ப்பு ஏற்பாட்டை உருவாக்குகின்றன, மேலும் இழைகள் I மற்றும் டி ஒரு இணையான தொடர்பு கொள்கின்றன.அட்டவணை 2 என்பது ஒரு சிறிய எதிர்-இணை-இரட்டை-இழைக்கப்பட்ட பீட்டா தாள் (இழைகள் E மற்றும் G).E சங்கிலியின் C-டெர்மினஸ் மற்றும் H சங்கிலியின் மையம் (Cys170-Cys226) (படம். S6b) ஆகியவற்றுக்கு இடையே ஒரு உள் டைசல்பைட் பிணைப்பு காணப்பட்டது.இம்யூனோகுளோபுலின் 40,41 இன் β-சாண்ட்விச் டொமைனில் உள்ள டிஸல்பைட் பிணைப்புக்கு இந்த டிஸல்பைடு பிணைப்பு ஒத்ததாகும்.
நான்கு இழை β-தாள் அதன் முழு நீளத்திலும் முறுக்கி, வடிவம் மற்றும் மின்னியல் ஆகியவற்றில் வேறுபடும் சமச்சீரற்ற விளிம்புகளை உருவாக்குகிறது.மெல்லிய விளிம்பு என்பது ஒரு தட்டையான ஹைட்ரோபோபிக் சுற்றுச்சூழல் மேற்பரப்பாகும், இது SPACA6 (படம். S6b,c) இல் மீதமுள்ள சீரற்ற மற்றும் மின்னியல் மாறுபட்ட மேற்பரப்புகளுடன் ஒப்பிடும்போது தனித்து நிற்கிறது.வெளிப்படும் முதுகெலும்பு கார்போனைல்/அமினோ குழுக்கள் மற்றும் துருவ பக்க சங்கிலிகளின் ஒளிவட்டம் ஹைட்ரோபோபிக் மேற்பரப்பைச் சுற்றி உள்ளது (படம். S6c).பரந்த விளிம்பு மூடப்பட்ட ஹெலிகல் பிரிவால் மூடப்பட்டிருக்கும், இது ஹைட்ரோபோபிக் மையத்தின் N-முனையப் பகுதியைத் தடுக்கிறது மற்றும் F சங்கிலி முதுகெலும்பின் (படம். S6d) திறந்த துருவக் குழுவுடன் மூன்று ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை உருவாக்குகிறது.இந்த விளிம்பின் சி-டெர்மினல் பகுதியானது பகுதியளவு வெளிப்படும் ஹைட்ரோபோபிக் மையத்துடன் ஒரு பெரிய பாக்கெட்டை உருவாக்குகிறது.இரட்டை அர்ஜினைன் எச்சங்கள் (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 மற்றும் Arg212-Arg214) மற்றும் ஒரு மைய ஹிஸ்டைடின் (His220) (படம் S6e) ஆகியவற்றின் காரணமாக பாக்கெட் பாசிட்டிவ் சார்ஜ்களால் சூழப்பட்டுள்ளது.
கீல் பகுதி என்பது ஹெலிகல் டொமைனுக்கும் Ig-போன்ற டொமைனுக்கும் இடையே உள்ள ஒரு குறுகிய பிரிவாகும், இதில் ஒரு எதிரெதிர் மூன்று-இழைகள் கொண்ட β-லேயர் (இழைகள் A, B மற்றும் C), ஒரு சிறிய 310 ஹெலிக்ஸ் மற்றும் பல நீண்ட சீரற்ற ஹெலிகல் பிரிவுகள் உள்ளன.(படம் S7).கீல் பகுதியில் உள்ள கோவலன்ட் மற்றும் எலக்ட்ரோஸ்டேடிக் தொடர்புகளின் நெட்வொர்க் 4HB மற்றும் Ig போன்ற டொமைனுக்கு இடையே உள்ள நோக்குநிலையை உறுதிப்படுத்துகிறது.நெட்வொர்க்கை மூன்று பகுதிகளாகப் பிரிக்கலாம்.முதல் பகுதியில் இரண்டு CXXC மையக்கருத்துகள் (27CXXC30 மற்றும் 139CXXC142) உள்ளன, அவை கீலில் உள்ள β-ஹேர்பின் மற்றும் 4HB இல் 1′ ஹெலிக்ஸ் இடையே ஒரு ஜோடி டிஸல்பைட் பிணைப்புகளை உருவாக்குகின்றன.இரண்டாம் பகுதியில் Ig-போன்ற டொமைன் மற்றும் கீலுக்கு இடையே உள்ள மின்னியல் தொடர்புகள் அடங்கும்.கீலில் உள்ள Glu132, Ig ​​போன்ற டொமைனில் Arg233 மற்றும் கீலில் Arg135 உடன் உப்புப் பாலத்தை உருவாக்குகிறது.மூன்றாவது பகுதியில் Ig-போன்ற டொமைன் மற்றும் கீல் பகுதிக்கு இடையே ஒரு கோவலன்ட் பிணைப்பு உள்ளது.இரண்டு டிஸல்பைட் பிணைப்புகள் (Cys124-Cys147 மற்றும் Cys128-Cys153) Gln131 மற்றும் முதுகெலும்பு செயல்பாட்டுக் குழுவிற்கு இடையேயான மின்னியல் தொடர்புகளால் நிலைப்படுத்தப்பட்ட இணைப்பாளருடன் கீல் வளையத்தை இணைக்கிறது, இது முதல் Ig போன்ற டொமைனை அணுக அனுமதிக்கிறது.சங்கிலி.
SPACA6 எக்டோடோமைனின் அமைப்பு மற்றும் 4HB மற்றும் Ig-போன்ற டொமைன்களின் தனிப்பட்ட கட்டமைப்புகள், புரத தரவுத்தளங்கள் 42 இல் கட்டமைப்பு ரீதியாக ஒத்த பதிவுகளைத் தேட பயன்படுத்தப்பட்டன.அதிக Dali Z மதிப்பெண்கள், சிறிய நிலையான விலகல்கள் மற்றும் பெரிய LALI மதிப்பெண்கள் (பிந்தையது கட்டமைப்பு ரீதியாக சமமான எச்சங்களின் எண்ணிக்கை) கொண்ட பொருத்தங்களை நாங்கள் கண்டறிந்தோம்.முழு எக்டோடோமைன் தேடலில் (அட்டவணை S1) முதல் 10 வெற்றிகள் ஏற்றுக்கொள்ளக்கூடிய Z-ஸ்கோர் >842 ஐக் கொண்டிருந்தாலும், 4HB அல்லது Ig-போன்ற டொமைனுக்கான தேடல் மட்டும் இந்த வெற்றிகளில் பெரும்பாலானவை β-சாண்ட்விச்களுடன் மட்டுமே ஒத்துப்போகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது.பல புரதங்களில் காணப்படும் எங்கும் நிறைந்த மடிப்பு.டாலியில் மூன்று தேடல்களும் ஒரே ஒரு முடிவை மட்டுமே அளித்தன: IZUMO1.
SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஆகியவை 7,32,37 கட்டமைப்பு ஒற்றுமைகளைப் பகிர்ந்துகொள்வதாக நீண்ட காலமாகப் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.இந்த இரண்டு கேமட் ஃப்யூஷன்-தொடர்புடைய புரதங்களின் எக்டோடோமைன்கள் 21% வரிசை அடையாளத்தை மட்டுமே பகிர்ந்து கொள்கின்றன (படம் S8a), பாதுகாக்கப்பட்ட டிஸல்பைட் பிணைப்பு முறை மற்றும் SPACA6 இல் கணிக்கப்பட்ட C-டெர்மினல் Ig-போன்ற டொமைன் உள்ளிட்ட சிக்கலான சான்றுகள், ஆரம்ப முயற்சிகளை உருவாக்க அனுமதித்தன. ஒரு டெம்ப்ளேட்டாக IZUMO1 ஐப் பயன்படுத்தி A a SPACA6 மவுஸின் ஹோமோலஜி மாதிரி.எங்கள் அமைப்பு இந்த கணிப்புகளை உறுதிப்படுத்துகிறது மற்றும் ஒற்றுமையின் உண்மையான அளவைக் காட்டுகிறது.உண்மையில், SPACA6 மற்றும் IZUMO137,43,44 கட்டமைப்புகள் ஒரே மாதிரியான 4HB மற்றும் Ig-போன்ற β-சாண்ட்விச் டொமைன்களுடன் (படம். S8c) இணைக்கப்பட்ட இரண்டு-டொமைன் கட்டமைப்பை (படம். S8b) பகிர்ந்து கொள்கின்றன.
IZUMO1 மற்றும் SPACA6 4HB ஆகியவை வழக்கமான சுழல் மூட்டைகளிலிருந்து பொதுவான வேறுபாடுகளைக் கொண்டுள்ளன.வழக்கமான 4HBகள், எண்டோசோமால் ஃப்யூஷன் 45,46 இல் ஈடுபட்டுள்ள SNARE புரோட்டீன் காம்ப்ளக்ஸ்களில் காணப்படுவதைப் போல, மத்திய அச்சில் ஒரு நிலையான வளைவை பராமரிக்கும் சம இடைவெளி ஹெலிகள் 47. இதற்கு மாறாக, IZUMO1 மற்றும் SPACA6 இரண்டிலும் உள்ள ஹெலிகல் டொமைன்கள் சிதைந்து, மாறி வளைவு மற்றும் சீரற்ற பேக்கிங் (படம் S8d).1′, 1 மற்றும் 2 ஹெலிஸ்களால் உருவாக்கப்பட்ட முக்கோணத்தால் ஏற்படும் திருப்பம், IZUMO1 மற்றும் SPACA6 இல் தக்கவைக்கப்பட்டு, ஹெலிக்ஸ் 1′ இல் அதே CXXC மையக்கருத்தினால் உறுதிப்படுத்தப்படுகிறது.இருப்பினும், SPACA6 இல் காணப்படும் கூடுதல் டிஸல்பைட் பிணைப்பு (Cys41 மற்றும் Cys55 இணையாக இணைக்கும் ஹெலிகள் 1 மற்றும் 2) முக்கோண உச்சியில் ஒரு கூர்மையான உச்சியை உருவாக்குகிறது, மேலும் SPACA6 ஐ IZUMO1 ஐ விட முறுக்குகிறது, மேலும் உச்சரிக்கப்படும் குழி முக்கோணங்களுடன்.கூடுதலாக, IZUMO1 இல் SPACA6 இல் இந்த குழியின் மையத்தில் காணப்பட்ட Arg37 இல்லை.மாறாக, IZUMO1 அலிபாடிக் மற்றும் நறுமண எச்சங்களின் மிகவும் பொதுவான ஹைட்ரோபோபிக் மையத்தைக் கொண்டுள்ளது.
IZUMO1 ஆனது இரட்டை இழை மற்றும் ஐந்து இழைகள் கொண்ட β-ஷீட்43 ஐக் கொண்ட Ig போன்ற டொமைனைக் கொண்டுள்ளது.IZUMO1 இல் உள்ள கூடுதல் இழையானது SPACA6 இல் உள்ள சுருளை மாற்றுகிறது, இது ஸ்ட்ராண்டில் முதுகெலும்பு ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகளை கட்டுப்படுத்த F ஸ்ட்ராண்டுடன் தொடர்பு கொள்கிறது.இரண்டு புரதங்களின் Ig-போன்ற களங்களின் கணிக்கப்பட்ட மேற்பரப்பு மின்னேற்றம் என்பது ஒப்பிடுவதற்கான ஒரு சுவாரஸ்யமான புள்ளியாகும்.IZUMO1 மேற்பரப்பு SPACA6 மேற்பரப்பை விட எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்டுள்ளது.விந்தணு சவ்வு எதிர்கொள்ளும் சி-டெர்மினஸ் அருகே கூடுதல் கட்டணம் உள்ளது.SPACA6 இல், அதே பகுதிகள் மிகவும் நடுநிலை அல்லது நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்டன (படம். S8e).எடுத்துக்காட்டாக, SPACA6 இல் உள்ள ஹைட்ரோபோபிக் மேற்பரப்பு (மெல்லிய விளிம்புகள்) மற்றும் நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட குழிகள் (அகலமான விளிம்புகள்) ஆகியவை IZUMO1 இல் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்படுகின்றன.
IZUMO1 மற்றும் SPACA6 இடையே உள்ள உறவு மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கூறுகள் நன்கு பாதுகாக்கப்பட்டாலும், Ig-போன்ற களங்களின் கட்டமைப்பு சீரமைப்பு இரண்டு களங்களும் ஒன்றுக்கொன்று தொடர்புடைய பொதுவான நோக்குநிலையில் வேறுபடுகின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது (படம். S9).IZUMO1 இன் சுழல் மூட்டையானது β-சாண்ட்விச் சுற்றி வளைந்து, மத்திய அச்சில் இருந்து சுமார் 50° இல் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட "பூமராங்" வடிவத்தை உருவாக்குகிறது.இதற்கு நேர்மாறாக, SPACA6 இல் உள்ள ஹெலிகல் பீம் எதிர் திசையில் சுமார் 10° சாய்ந்தது.இந்த நோக்குநிலைகளில் உள்ள வேறுபாடுகள் கீல் பகுதியில் உள்ள வேறுபாடுகள் காரணமாக இருக்கலாம்.முதன்மை வரிசை மட்டத்தில், IZUMO1 மற்றும் SPACA6 ஆகியவை சிஸ்டைன், கிளைசின் மற்றும் அஸ்பார்டிக் அமில எச்சங்களைத் தவிர்த்து, கீலில் சிறிய வரிசை ஒற்றுமையைப் பகிர்ந்து கொள்கின்றன.இதன் விளைவாக, ஹைட்ரஜன் பிணைப்புகள் மற்றும் மின்னியல் நெட்வொர்க்குகள் முற்றிலும் வேறுபட்டவை.β-தாள் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கூறுகள் IZUMO1 மற்றும் SPACA6 ஆல் பகிர்ந்து கொள்ளப்படுகின்றன, இருப்பினும் IZUMO1 இல் உள்ள சங்கிலிகள் மிகவும் நீளமானது மற்றும் 310 ஹெலிக்ஸ் (ஹெலிக்ஸ் 5) SPACA6 க்கு தனித்துவமானது.இந்த வேறுபாடுகள் ஒரே மாதிரியான இரண்டு புரதங்களுக்கு வெவ்வேறு டொமைன் நோக்குநிலைகளை ஏற்படுத்துகின்றன.
எங்கள் டாலி சர்வர் தேடல், SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஆகியவை இந்த குறிப்பிட்ட 4HB மடங்கு (அட்டவணை S1) கொண்ட புரத தரவுத்தளத்தில் சேமிக்கப்பட்ட இரண்டு சோதனை ரீதியாக தீர்மானிக்கப்பட்ட கட்டமைப்புகள் மட்டுமே என்பதை வெளிப்படுத்தியது.மிக சமீபத்தில், DeepMind (Alphabet/Google) ஆனது AlphaFold ஐ உருவாக்கியுள்ளது, இது ஒரு நரம்பியல் நெட்வொர்க் அடிப்படையிலான அமைப்பாகும், இது முதன்மை வரிசைகளிலிருந்து புரதங்களின் 3D கட்டமைப்புகளை துல்லியமாக கணிக்க முடியும்.SPACA6 கட்டமைப்பை நாங்கள் தீர்த்த சிறிது நேரத்திற்குப் பிறகு, ஆல்பாஃபோல்ட் தரவுத்தளம் வெளியிடப்பட்டது, இது மனித புரோட்டீமில் உள்ள அனைத்து புரதங்களில் 98.5% உள்ளடக்கிய முன்கணிப்பு கட்டமைப்பு மாதிரிகளை வழங்குகிறது.எங்கள் தீர்க்கப்பட்ட SPACA6 கட்டமைப்பை ஒரு தேடல் மாதிரியாகப் பயன்படுத்தி, ஆல்பாஃபோல்ட் ஹ்யூமன் புரோட்டியோமில் உள்ள மாதிரிக்கான கட்டமைப்பு ஹோமோலஜி தேடல் SPACA6 மற்றும் IZUMO1 உடன் சாத்தியமான கட்டமைப்பு ஒற்றுமைகளைக் கொண்ட வேட்பாளர்களை அடையாளம் கண்டுள்ளது.SPACA6 (படம். S10a) கணிப்பதில் AlphaFold இன் நம்பமுடியாத துல்லியம்-குறிப்பாக 1.1 Å rms எக்டோடோமைன் எங்களின் தீர்க்கப்பட்ட அமைப்புடன் ஒப்பிடும்போது (படம். S10b) - அடையாளம் காணப்பட்ட SPACA6 பொருத்தங்கள் துல்லியமாக இருக்கும் என்று நம்பலாம்.
முன்னதாக, PSI-BLAST ஆனது மற்ற மூன்று விந்தணுக்களுடன் தொடர்புடைய IZUMO1 கிளஸ்டரைத் தேடியது: IZUMO2, IZUMO3 மற்றும் IZUMO450.இந்த IZUMO குடும்ப புரதங்கள் 4HB டொமைனில் IZUMO1 (புள்ளிவிவரங்கள் 3a மற்றும் S11) போன்ற அதே டைசல்பைட் பிணைப்பு வடிவத்துடன் மடிகின்றன என்று AlphaFold கணித்துள்ளது, இருப்பினும் அவை Ig-போன்ற டொமைன் இல்லை.IZUMO2 மற்றும் IZUMO3 ஆகியவை IZUMO1 ஐப் போன்ற ஒரு பக்க சவ்வு புரதங்கள் என்று அனுமானிக்கப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் IZUMO4 சுரக்கப்படுகிறது.கேமட் இணைவில் IZUMO 2, 3 மற்றும் 4 புரதங்களின் செயல்பாடுகள் தீர்மானிக்கப்படவில்லை.IZUMO3 விந்தணு வளர்ச்சியின் போது அக்ரோசோம் பயோஜெனீசிஸில் பங்கு வகிப்பதாக அறியப்படுகிறது51 மற்றும் IZUMO புரதம் சிக்கலான50 ஐ உருவாக்குகிறதுபாலூட்டிகள், ஊர்வன மற்றும் நீர்வீழ்ச்சிகளில் IZUMO புரதங்களின் பாதுகாப்பு, அவற்றின் சாத்தியமான செயல்பாடு DCST1/2, SOF1 மற்றும் FIMP போன்ற பிற அறியப்பட்ட கேமட்-ஃப்யூஷன்-தொடர்புடைய புரதங்களுடன் ஒத்துப்போகிறது என்று கூறுகிறது.
IST சூப்பர் குடும்பத்தின் டொமைன் கட்டமைப்பின் வரைபடம், 4HB, கீல் மற்றும் Ig போன்ற டொமைன்கள் முறையே ஆரஞ்சு, பச்சை மற்றும் நீல நிறங்களில் சிறப்பிக்கப்பட்டுள்ளன.IZUMO4 கறுப்பாகத் தோற்றமளிக்கும் தனித்துவமான சி-டெர்மினல் பகுதியைக் கொண்டுள்ளது.உறுதிப்படுத்தப்பட்ட மற்றும் தூண்டக்கூடிய டிஸல்பைட் பிணைப்புகள் முறையே திடமான மற்றும் புள்ளியிடப்பட்ட கோடுகளால் காட்டப்படுகின்றன.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (ஆல்ஃபாஃபோல்டு DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (ஆல்ஃபாஃபோல்ட் DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (ஆல்ஃபாஃபோல்டு DB: AF-Q1ZYLFA5), (அந்தக் 8-F5 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) பேனல் A போன்ற அதே வண்ண வரம்பில் காட்டப்படும். டிஸல்பைடு பிணைப்புகள் மெஜந்தாவில் காட்டப்பட்டுள்ளன.TMEM95, IZUMO2 மற்றும் IZUMO3 டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் ஹெலிகள் காட்டப்படவில்லை.
IZUMO புரதத்தைப் போலல்லாமல், மற்ற SPACA புரதங்கள் (அதாவது, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 மற்றும் SPACA9) SPACA6 (படம் S12) இலிருந்து வேறுபட்டதாகக் கருதப்படுகிறது.SPACA9 மட்டுமே 4HB ஐக் கொண்டுள்ளது, ஆனால் இது SPACA6 போன்ற அதே இணையான-இணை-இணை-எதிர்ப்பு நோக்குநிலை அல்லது அதே டிஸல்பைட் பிணைப்பைக் கொண்டிருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படவில்லை.SPACA1 மட்டுமே இதே போன்ற Ig போன்ற டொமைனைக் கொண்டுள்ளது.SPACA3, SPACA4 மற்றும் SPACA5 ஆகியவை SPACA6 ஐ விட முற்றிலும் மாறுபட்ட கட்டமைப்பைக் கொண்டுள்ளன என்று AlphaFold கணித்துள்ளது.சுவாரஸ்யமாக, SPACA4 கருத்தரிப்பதில் பங்கு வகிக்கிறது, ஆனால் SPACA6 ஐ விட அதிக அளவில், அதற்கு பதிலாக விந்தணு மற்றும் ஓசைட் சோனா பெல்லுசிடா52 இடையேயான தொடர்புகளை எளிதாக்குகிறது.
எங்கள் AlphaFold தேடலில் IZUMO1 மற்றும் SPACA6 4HB, TMEM95 ஆகியவற்றுக்கான மற்றொரு பொருத்தம் கண்டறியப்பட்டது.TMEM95, ஒரு விந்தணு-குறிப்பிட்ட டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் புரதம், ஆண் எலிகளை 32,33 குறைக்கும்போது மலட்டுத்தன்மையடையச் செய்கிறது.TMEM95 இல்லா விந்தணுக்கள் இயல்பான உருவவியல், இயக்கம் மற்றும் ஜோனா பெல்லுசிடாவை ஊடுருவி முட்டை சவ்வுடன் பிணைக்கும் திறனைக் கொண்டிருந்தன, ஆனால் ஓசைட் சவ்வுடன் இணைக்க முடியவில்லை.முந்தைய ஆய்வுகள் TMEM95 IZUMO133 உடன் கட்டமைப்பு ஒற்றுமைகளைப் பகிர்ந்து கொள்கிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.உண்மையில், AlphaFold மாதிரியானது, TMEM95 என்பது IZUMO1 மற்றும் SPACA6 போன்ற அதே ஜோடி CXXC மையக்கருத்துக்களைக் கொண்ட 4HB மற்றும் SPACA6 (படம். 3a மற்றும் S11) இல் காணப்படும் ஹெலிகள் 1 மற்றும் 2 க்கு இடையில் அதே கூடுதல் டிஸல்பைட் பிணைப்பைக் கொண்டது என்பதை உறுதிப்படுத்தியது.TMEM95 இல் Ig போன்ற டொமைன் இல்லாவிட்டாலும், SPACA6 மற்றும் IZUMO1 கீல் பகுதிகள் (படம் 3b) போன்ற ஒரு டைசல்பைட் பிணைப்பு வடிவத்தைக் கொண்ட ஒரு பகுதியைக் கொண்டுள்ளது.இந்த கையெழுத்துப் பிரதியை வெளியிடும் நேரத்தில், முன்அச்சு சேவையகம் TMEM95 இன் கட்டமைப்பைப் புகாரளித்தது, இது AlphaFold53 முடிவை உறுதிப்படுத்துகிறது.TMEM95 ஆனது SPACA6 மற்றும் IZUMO1 உடன் மிகவும் ஒத்திருக்கிறது மற்றும் ஏற்கனவே நீர்வீழ்ச்சிகளில் பரிணாம ரீதியாக பாதுகாக்கப்படுகிறது (படம் 4 மற்றும் S13).
PSI-BLAST தேடலானது NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP மற்றும் SOF1 தரவுத்தளங்களைப் பயன்படுத்தி வாழ்க்கை மரத்தில் இந்த வரிசைகளின் நிலையைத் தீர்மானிக்கிறது.கிளை புள்ளிகளுக்கு இடையே உள்ள தூரம் அளவிடப்படாது.
SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஆகியவற்றுக்கு இடையே உள்ள குறிப்பிடத்தக்க ஒட்டுமொத்த கட்டமைப்பு ஒற்றுமை, அவர்கள் TMEM95 மற்றும் IZUMO 2, 3 மற்றும் 4 புரதங்களை உள்ளடக்கிய பாதுகாக்கப்பட்ட கட்டமைப்பு சூப்பர் குடும்பத்தின் ஸ்தாபக உறுப்பினர்களாக இருப்பதாக தெரிவிக்கிறது.அறியப்பட்ட உறுப்பினர்கள்: IZUMO1, SPACA6 மற்றும் TMEM95.ஒரு சில உறுப்பினர்கள் மட்டுமே Ig போன்ற டொமைன்களைக் கொண்டிருப்பதால், IST சூப்பர்ஃபாமிலியின் தனிச்சிறப்பு 4HB டொமைன் ஆகும், இது இந்த புரதங்கள் அனைத்திற்கும் பொதுவான தனித்துவமான அம்சங்களைக் கொண்டுள்ளது: 1) சுருள் 4HB ஹெலிகள் உடன் இணை எதிர்ப்பு/பேரலல் ஆல்டர்னேஷனில் ஏற்பாடு செய்யப்பட்டுள்ளது (படம் . 5a), 2) மூட்டையானது மூட்டைக்குள் இரண்டு ஹெலிக்ஸ் மற்றும் மூன்றாவது செங்குத்து ஹெலிக்ஸ் (படம். முக்கிய பகுதி (படம். 5c) கொண்ட ஒரு முக்கோண முகத்தைக் கொண்டுள்ளது. தியோரெடாக்சின் போன்ற புரதங்களில் காணப்படும் CXXC மையக்கருத்து செயல்படுவதாக அறியப்படுகிறது. ஒரு ரெடாக்ஸ் சென்சார் 54,55,56 , அதே சமயம் IST குடும்ப உறுப்பினர்களின் மையக்கருத்தை கேமட் ஃப்யூஷனில் உள்ள ERp57 போன்ற புரோட்டீன் டைசல்பைட் ஐசோமரேஸ்களுடன் தொடர்புபடுத்தலாம்.
IST சூப்பர்ஃபாமிலியின் உறுப்பினர்கள் 4HB டொமைனின் மூன்று சிறப்பியல்பு அம்சங்களால் வரையறுக்கப்படுகிறார்கள்: இணை மற்றும் எதிரெதிர் நோக்குநிலைக்கு இடையில் மாறிவரும் நான்கு ஹெலிகள், BA-முக்கோண ஹெலிகல் மூட்டை முகங்கள் மற்றும் சிறிய மூலக்கூறுகளுக்கு இடையில் உருவாக்கப்பட்ட ஒரு ca CXXC இரட்டை மையக்கருத்து.) N-டெர்மினல் ஹெலிக்ஸ் (ஆரஞ்சு) மற்றும் கீல் பகுதி β-ஹேர்பின் (பச்சை).
SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஆகியவற்றுக்கு இடையே உள்ள ஒற்றுமையைக் கருத்தில் கொண்டு, IZUMO1 அல்லது JUNO உடன் பிணைக்கும் முன்னாள் திறன் சோதிக்கப்பட்டது.பயோலேயர் இன்டர்ஃபெரோமெட்ரி (BLI) என்பது இயக்கவியல் அடிப்படையிலான பிணைப்பு முறையாகும், இது முன்னர் IZUMO1 மற்றும் JUNO க்கு இடையேயான தொடர்புகளை அளவிட பயன்படுத்தப்பட்டது.பயோட்டின்-லேபிளிடப்பட்ட உணரியை IZUMO1 உடன் அதிக செறிவு கொண்ட JUNO அனலைட் கொண்ட தூண்டில் அடைகாத்த பிறகு, ஒரு வலுவான சமிக்ஞை கண்டறியப்பட்டது (படம். S14a), இது சென்சார் முனையில் இணைக்கப்பட்ட பயோமெட்டீரியலின் தடிமனில் பிணைப்பு-தூண்டப்பட்ட மாற்றத்தைக் குறிக்கிறது.இதே போன்ற சமிக்ஞைகள் (அதாவது, IZUMO1 பகுப்பாய்விற்கு எதிரான தூண்டில் சென்சாருடன் JUNO இணைக்கப்பட்டுள்ளது) (படம். S14b).SPACA6 சென்சார்-பிவுண்ட் IZUMO1 அல்லது சென்சார்-பவுண்ட் JUNO (படம் S14a,b) க்கு எதிராக பகுப்பாய்வாகப் பயன்படுத்தப்பட்டபோது எந்த சமிக்ஞையும் கண்டறியப்படவில்லை.இந்த சமிக்ஞை இல்லாதது SPACA6 இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைன் IZUMO1 அல்லது JUNO இன் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைனுடன் தொடர்பு கொள்ளவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது.
BLI மதிப்பீடு தூண்டில் புரதத்தில் இலவச லைசின் எச்சங்களின் பயோடைனிலேஷனை அடிப்படையாகக் கொண்டிருப்பதால், லைசின் எச்சங்கள் தொடர்புகளில் ஈடுபட்டிருந்தால், இந்த மாற்றம் பிணைப்பைத் தடுக்கலாம்.கூடுதலாக, சென்சாருடன் தொடர்புடைய பிணைப்பின் நோக்குநிலை ஸ்டெரிக் தடைகளை உருவாக்கலாம், எனவே வழக்கமான புல்-டவுன் மதிப்பீடுகள் மறுசீரமைப்பு SPACA6, IZUMO1 மற்றும் ஜூனோ எக்டோடோமைன்களிலும் நிகழ்த்தப்பட்டன.இது இருந்தபோதிலும், SPACA6 அவரது-குறியிடப்பட்ட IZUMO1 அல்லது அவரது-குறியிடப்பட்ட JUNO (படம். S14c,d) உடன் வீழ்ச்சியடையவில்லை, இது BLI சோதனைகளில் காணப்பட்ட தொடர்புகளுடன் ஒத்துப்போகவில்லை.ஒரு நேர்மறையான கட்டுப்பாட்டாக, அவருடைய IZUMO1 (புள்ளிவிவரங்கள் S14e மற்றும் S15) என்று பெயரிடப்பட்ட ஜூனோவின் தொடர்புகளை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம்.
SPACA6 மற்றும் IZUMO1 க்கு இடையே உள்ள கட்டமைப்பு ஒற்றுமை இருந்தபோதிலும், SPACA6 க்கு JUNO ஐ பிணைக்க இயலாமையில் ஆச்சரியமில்லை.மனித IZUMO1 இன் மேற்பரப்பில் 20 க்கும் மேற்பட்ட எச்சங்கள் உள்ளன, அவை ஜூனோவுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன, இதில் ஒவ்வொரு மூன்று பகுதிகளிலிருந்தும் எச்சங்கள் உள்ளன (அவற்றில் பெரும்பாலானவை கீல் பகுதியில் அமைந்திருந்தாலும்) (படம். S14f).இந்த எச்சங்களில் ஒன்று மட்டுமே SPACA6 (Glu70) இல் பாதுகாக்கப்படுகிறது.பல எச்ச மாற்றுகள் அவற்றின் அசல் உயிர்வேதியியல் பண்புகளை தக்கவைத்துக்கொண்டாலும், IZUMO1 இல் உள்ள அத்தியாவசிய Arg160 எச்சம் SPACA6 இல் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட Asp148 ஆல் மாற்றப்பட்டது;முந்தைய ஆய்வுகள் IZUMO1 இல் உள்ள Arg160Glu பிறழ்வு JUNO43 உடன் பிணைப்பதை முற்றிலும் நீக்குகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.கூடுதலாக, IZUMO1 மற்றும் SPACA6 க்கு இடையிலான டொமைன் நோக்குநிலை வேறுபாடு SPACA6 (படம் S14g) இல் சமமான பகுதியின் ஜூனோ-பிணைப்பு தளத்தின் பரப்பளவை கணிசமாக அதிகரித்தது.
கேமட் ஃப்யூசனுக்கான SPACA6 இன் தேவை மற்றும் IZUMO1 உடன் அதன் ஒற்றுமை இருந்தபோதிலும், SPACA6 க்கு சமமான JUNO பிணைப்பு செயல்பாடு இருப்பதாகத் தெரியவில்லை.எனவே, பரிணாம உயிரியலால் வழங்கப்பட்ட முக்கியத்துவத்தின் சான்றுகளுடன் எங்கள் கட்டமைப்புத் தரவை இணைக்க முயன்றோம்.SPACA6 ஹோமோலாக்ஸின் வரிசை சீரமைப்பு பாலூட்டிகளுக்கு அப்பாற்பட்ட பொதுவான கட்டமைப்பின் பாதுகாப்பைக் காட்டுகிறது.எடுத்துக்காட்டாக, சிஸ்டைன் எச்சங்கள் தொலைதூர தொடர்புடைய நீர்வீழ்ச்சிகளில் கூட உள்ளன (படம் 6a).ConSurf சேவையகத்தைப் பயன்படுத்தி, 66 வரிசைகளின் பல வரிசை சீரமைப்பு தக்கவைப்பு தரவு SPACA6 மேற்பரப்பில் வரைபடமாக்கப்பட்டது.இந்த வகை பகுப்பாய்வு புரத பரிணாம வளர்ச்சியின் போது எந்த எச்சங்கள் பாதுகாக்கப்பட்டுள்ளன என்பதைக் காட்டலாம் மற்றும் எந்த மேற்பரப்பு பகுதிகள் செயல்பாட்டில் பங்கு வகிக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கலாம்.
CLUSTAL OMEGA ஐப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்பட்ட 12 வெவ்வேறு இனங்களிலிருந்து SPACA6 எக்டோடோமைன்களின் வரிசை சீரமைப்பு.ConSurf பகுப்பாய்வின் படி, மிகவும் பழமைவாத நிலைகள் நீல நிறத்தில் குறிக்கப்பட்டுள்ளன.சிஸ்டைன் எச்சங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன.டொமைன் எல்லைகள் மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கூறுகள் சீரமைப்பின் மேற்பகுதியில் காட்டப்படுகின்றன, அம்புகள் β-ஸ்ட்ராண்ட்களைக் குறிக்கின்றன மற்றும் அலைகள் ஹெலிகளைக் குறிக்கின்றன.வரிசைகளைக் கொண்ட NCBI அணுகல் அடையாளங்காட்டிகள்: மனித (ஹோமோ சேபியன்ஸ், NP_001303901), மாண்ட்ரில் (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin குரங்கு (Cebus mimic, XP_017359360), குதிரை2 கில்லர்2 (XP_0 360 caball), le (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), செம்மறி ஆடுகள் (Ovis aries, XP_014955560), யானை (Loxodonta africana, XP_010585293), நாய் (Canis lupus familyis, XP_025277208), சுட்டி (Mus musculus, NP_001156301156381) XP_0318), பிளாட்டிபஸ், 8) , 61_89 மற்றும் புல்ஃப்ராக் (Bufo bufo, XP_040282113).எண்கள் மனித வரிசையை அடிப்படையாகக் கொண்டவை.b SPACA6 கட்டமைப்பின் மேற்பரப்புப் பிரதிநிதித்துவம், மேலே 4HB மற்றும் கீழே Ig-போன்ற டொமைன், ConSurf சேவையகத்தின் பாதுகாப்பு மதிப்பீடுகளின் அடிப்படையில் வண்ணங்கள்.சிறந்த பாதுகாக்கப்பட்ட பாகங்கள் நீல நிறத்திலும், மிதமாக பாதுகாக்கப்பட்ட பாகங்கள் வெள்ளை நிறத்திலும், குறைந்தபட்சம் மஞ்சள் நிறத்திலும் உள்ளன.ஊதா சிஸ்டைன்.1, 2 மற்றும் 3 என பெயரிடப்பட்ட இணைப்புகளில் அதிக அளவிலான பாதுகாப்பைக் காட்டும் மூன்று மேற்பரப்புத் திட்டுகள் காட்டப்பட்டுள்ளன. மேல் வலதுபுறத்தில் உள்ள இன்செட்டில் 4HB கார்ட்டூன் காட்டப்பட்டுள்ளது (அதே வண்ணத் திட்டம்).
SPACA6 அமைப்பு மூன்று மிகவும் பாதுகாக்கப்பட்ட மேற்பரப்பு பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளது (படம் 6b).பேட்ச் 1 ஆனது 4HB மற்றும் கீல் பகுதியில் பரவுகிறது மற்றும் இரண்டு பாதுகாக்கப்பட்ட CXXC டைசல்பைட் பாலங்கள், ஒரு Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 கீல் நெட்வொர்க் (படம். S7) மற்றும் மூன்று பாதுகாக்கப்பட்ட வெளிப்புற நறுமண எச்சங்கள் (Phe31, Tyr373, Phe1373) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.Ig-போன்ற டொமைனின் ஒரு பரந்த விளிம்பு (படம். S6e), இது விந்தணு மேற்பரப்பில் பல நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்களைக் குறிக்கிறது.சுவாரஸ்யமாக, இந்த பேட்ச் SPACA6 30 செயல்பாட்டில் தலையிடுவதாகக் காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடி எபிடோப்பைக் கொண்டுள்ளது.மண்டலம் 3 கீல் மற்றும் Ig போன்ற டொமைனின் ஒரு பக்கத்தை விரிவுபடுத்துகிறது;இந்த பகுதியில் பாதுகாக்கப்பட்ட புரோலைன்கள் (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) மற்றும் வெளிப்புறமாக எதிர்கொள்ளும் துருவ/சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்கள் உள்ளன.வியக்கத்தக்க வகையில், 4HB இன் மேற்பரப்பில் உள்ள பெரும்பாலான எச்சங்கள் மிகவும் மாறக்கூடியவை (படம். 6b), இருப்பினும் மடிப்புகள் SPACA6 ஹோமோலாக் முழுவதும் (ஹைட்ரோபோபிக் மூட்டை மையத்தின் பழமைவாதத்தால் குறிப்பிடப்பட்டுள்ளது) மற்றும் IST சூப்பர்ஃபாமிலிக்கு அப்பால் பாதுகாக்கப்படுகிறது.
SPACA6 இல் இது மிகக் குறைவான கண்டறியக்கூடிய இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு கூறுகளைக் கொண்ட மிகச்சிறிய பகுதி என்றாலும், பல கீல் பகுதி எச்சங்கள் (பகுதி 3 உட்பட) SPACA6 ஹோமோலாக்ஸில் மிகவும் பாதுகாக்கப்படுகின்றன, இது ஹெலிகல் மூட்டை மற்றும் β-சாண்ட்விச்சின் நோக்குநிலை ஒரு பாத்திரத்தை வகிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கலாம்.ஒரு பழமைவாதியாக.இருப்பினும், SPACA6 மற்றும் IZUMO1 கீல் பகுதியில் விரிவான ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு மற்றும் மின்னியல் நெட்வொர்க்குகள் இருந்தபோதிலும், IZUMO137,43,44 இன் அனுமதிக்கப்பட்ட பல கட்டமைப்புகளின் சீரமைப்பில் உள்ளார்ந்த நெகிழ்வுத்தன்மையின் சான்றுகள் காணப்படுகின்றன.தனிப்பட்ட களங்களின் சீரமைப்பு நன்றாக ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்ந்தது, ஆனால் ஒன்றுக்கொன்று தொடர்புடைய களங்களின் நோக்குநிலை மைய அச்சில் இருந்து 50° முதல் 70° வரை மாறுபடுகிறது (படம். S16).கரைசலில் SPACA6 இன் இணக்க இயக்கவியலைப் புரிந்து கொள்ள, SAXS சோதனைகள் செய்யப்பட்டன (படம். S17a,b).SPACA6 எக்டோடோமைனின் ஆரம்ப புனரமைப்பு ஒரு தடி படிக அமைப்புக்கு (படம். S18) இணங்கியது, இருப்பினும் கிராட்கி சதி ஓரளவு நெகிழ்வுத்தன்மையைக் காட்டியது (படம். S17b).இந்த இணக்கமானது IZUMO1 உடன் முரண்படுகிறது, இதில் கட்டற்ற புரதமானது லட்டு மற்றும் கரைசலில் பூமராங் வடிவத்தை எடுத்துக்கொள்கிறது.
நெகிழ்வான பகுதியை குறிப்பாக அடையாளம் காண, ஹைட்ரஜன்-டியூட்டீரியம் பரிமாற்ற மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (H-DXMS) SPACA6 இல் செய்யப்பட்டது மற்றும் IZUMO143 (படம் 7a,b) இல் முன்னர் பெறப்பட்ட தரவுகளுடன் ஒப்பிடப்பட்டது.SPACA6 தெளிவாக IZUMO1 ஐ விட நெகிழ்வானது, 100,000 வினாடிகள் பரிமாற்றத்திற்குப் பிறகு கட்டமைப்பு முழுவதும் அதிக டியூட்டீரியம் பரிமாற்றத்தால் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.இரண்டு கட்டமைப்புகளிலும், கீல் பகுதியின் சி-டெர்மினல் பகுதி அதிக அளவிலான பரிமாற்றத்தைக் காட்டுகிறது, இது ஒன்றுக்கொன்று தொடர்புடைய 4HB மற்றும் Ig-போன்ற டொமைன்களின் வரையறுக்கப்பட்ட சுழற்சியை அனுமதிக்கிறது.சுவாரஸ்யமாக, 147CDLPLDCP154 எச்சத்தை உள்ளடக்கிய SPACA6 கீலின் C-டெர்மினல் பகுதி, மிகவும் பாதுகாக்கப்பட்ட பகுதி 3 (படம். 6b) ஆகும், இது இன்டர்டொமைன் நெகிழ்வுத்தன்மை என்பது SPACA6 இன் பரிணாம ரீதியாக பாதுகாக்கப்பட்ட அம்சமாகும்.நெகிழ்வுத்தன்மை பகுப்பாய்வின்படி, CD வெப்ப உருகும் தரவு SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (படம். S1e மற்றும் S19) விட நிலையானது என்று காட்டுகிறது.
SPACA6 மற்றும் b IZUMO1 இன் H-DXMS படங்கள்.டியூட்டீரியம் பரிமாற்ற சதவீதம் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேர புள்ளிகளில் தீர்மானிக்கப்பட்டது.ஹைட்ரஜன்-டியூட்டீரியம் பரிமாற்றத்தின் அளவுகள் நீலம் (10%) முதல் சிவப்பு (90%) வரை சாய்வு அளவில் நிறத்தால் குறிக்கப்படுகிறது.கருப்பு பெட்டிகள் அதிக பரிமாற்றம் உள்ள பகுதிகளைக் குறிக்கின்றன.படிக அமைப்பில் காணப்பட்ட 4HB, கீல் மற்றும் Ig போன்ற டொமைனின் எல்லைகள் முதன்மை வரிசைக்கு மேலே காட்டப்பட்டுள்ளன.10 வி, 1000 வி மற்றும் 100,000 நொடிகளில் டியூட்டிரியம் பரிமாற்ற அளவுகள் SPACA6 மற்றும் IZUMO1 இன் வெளிப்படையான மூலக்கூறு பரப்புகளில் மிகைப்படுத்தப்பட்ட ஒரு துண்டு விளக்கப்படத்தில் திட்டமிடப்பட்டது.50% க்கும் குறைவான டியூட்டீரியம் பரிமாற்ற அளவு கொண்ட கட்டமைப்புகளின் பாகங்கள் வெள்ளை நிறத்தில் உள்ளன.50% H-DXMS பரிமாற்றத்திற்கு மேல் உள்ள பகுதிகள் சாய்வு அளவில் வண்ணத்தில் உள்ளன.
CRISPR/Cas9 மற்றும் மவுஸ் மரபணு நாக் அவுட் மரபணு உத்திகளின் பயன்பாடு விந்தணு மற்றும் முட்டை பிணைப்பு மற்றும் இணைவு ஆகியவற்றிற்கு முக்கியமான பல காரணிகளை அடையாளம் காண வழிவகுத்தது.IZUMO1-JUNO மற்றும் CD9 கட்டமைப்பின் நன்கு வகைப்படுத்தப்பட்ட தொடர்புகளைத் தவிர, கேமட் இணைவுடன் தொடர்புடைய பெரும்பாலான புரதங்கள் கட்டமைப்பு ரீதியாகவும் செயல்பாட்டு ரீதியாகவும் புதிராகவே இருக்கின்றன.SPACA6 இன் உயிர் இயற்பியல் மற்றும் கட்டமைப்பு தன்மையானது கருத்தரிப்பின் போது ஒட்டுதல்/இணைவு மூலக்கூறு புதிரின் மற்றொரு பகுதியாகும்.
SPACA6 மற்றும் IST சூப்பர் குடும்பத்தின் பிற உறுப்பினர்கள் பாலூட்டிகள் மற்றும் தனிப்பட்ட பறவைகள், ஊர்வன மற்றும் நீர்வீழ்ச்சிகளில் மிகவும் பாதுகாக்கப்பட்டதாகத் தெரிகிறது;உண்மையில், ஜீப்ராஃபிஷ் 59 இல் கருத்தரிப்பதற்கு SPACA6 கூட தேவை என்று கருதப்படுகிறது. இந்த விநியோகமானது DCST134, DCST234, FIMP31 மற்றும் SOF132 போன்ற பிற அறியப்பட்ட கேமட் ஃப்யூஷன்-தொடர்புடைய புரதங்களைப் போலவே உள்ளது, இந்த காரணிகள் HAP2-குறைபாடுடையவை (மேலும்) GCS1 என அழைக்கப்படும்) புரதங்கள் பல புரோட்டிஸ்ட்டுகளின் வினையூக்க செயல்பாட்டிற்கு காரணமாகின்றன., தாவரங்கள் மற்றும் ஆர்த்ரோபாட்கள்.கருவுற்ற இணைவு புரதங்கள் 60, 61. SPACA6 மற்றும் IZUMO1 ஆகியவற்றுக்கு இடையே வலுவான கட்டமைப்பு ஒற்றுமை இருந்தபோதிலும், இந்த புரதங்களில் ஏதேனும் ஒன்றை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுக்களின் நாக் அவுட் ஆண் எலிகளில் மலட்டுத்தன்மையை ஏற்படுத்தியது, கேமட் இணைவில் அவற்றின் செயல்பாடுகள் நகல் இல்லை என்பதைக் குறிக்கிறது..இன்னும் விரிவாக, இணைவின் ஒட்டுதல் கட்டத்திற்குத் தேவையான அறியப்பட்ட விந்தணு புரதங்கள் எதுவும் தேவையற்றதாக இல்லை.
SPACA6 (மற்றும் IST சூப்பர்ஃபாமிலியின் மற்ற உறுப்பினர்கள்) இண்டர்காமெடிக் சந்திப்புகளில் பங்கேற்கிறார்களா, இணைவுப் புள்ளிகளுக்கு முக்கியமான புரதங்களை ஆட்சேர்ப்பு செய்ய இன்ட்ராகாமெடிக் நெட்வொர்க்குகளை உருவாக்குகிறார்களா அல்லது ஒருவேளை மழுப்பலான ஃபுசோஜென்களாக செயல்படுகிறார்களா என்பது ஒரு திறந்த கேள்வியாகவே உள்ளது.HEK293T செல்களில் இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் ஆய்வுகள் முழு நீள IZUMO1 மற்றும் SPACA632 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்புகளை வெளிப்படுத்தின.எவ்வாறாயினும், எங்கள் மறுசீரமைப்பு எக்டோடோமைன்கள் விட்ரோவில் தொடர்பு கொள்ளவில்லை, இது நோடா மற்றும் பலவற்றில் காணப்படும் தொடர்புகளைக் குறிக்கிறது.கட்டுமானத்தில் இரண்டும் நீக்கப்பட்டன (IZUMO1 இன் சைட்டோபிளாஸ்மிக் வால், கருத்தரிப்பதற்கு தேவையற்றது என்று காட்டப்பட்டுள்ளது62).மாற்றாக, IZUMO1 மற்றும்/அல்லது SPACA6 க்கு நாம் விட்ரோவில் இனப்பெருக்கம் செய்யாத குறிப்பிட்ட பிணைப்பு சூழல்கள் தேவைப்படலாம், அதாவது உடலியல் ரீதியாக குறிப்பிட்ட இணக்கங்கள் அல்லது பிற புரதங்களைக் கொண்ட மூலக்கூறு வளாகங்கள் (அறியப்பட்டவை அல்லது இன்னும் கண்டுபிடிக்கப்படவில்லை).IZUMO1 எக்டோடோமைன் பெரிவிடலைன் இடத்தில் முட்டையுடன் விந்தணுவை இணைப்பதை மத்தியஸ்தம் செய்வதாக நம்பப்பட்டாலும், SPACA6 எக்டோடோமைனின் நோக்கம் தெளிவாக இல்லை.
SPACA6 இன் அமைப்பு புரதம்-புரத தொடர்புகளில் ஈடுபடக்கூடிய பல பாதுகாக்கப்பட்ட மேற்பரப்புகளை வெளிப்படுத்துகிறது.CXXC மையக்கருத்திற்கு (மேலே நியமிக்கப்பட்ட பேட்ச் 1) உடனடியாக ஒட்டியிருக்கும் கீல் பகுதியின் பாதுகாக்கப்பட்ட பகுதியானது பல வெளிப்புறமாக எதிர்கொள்ளும் நறுமண எச்சங்களைக் கொண்டுள்ளது, அவை பெரும்பாலும் ஹைட்ரோபோபிக் மற்றும் π-ஸ்டாக்கிங் இடைவினைகளுடன் உயிரி மூலக்கூறுகளுக்கு இடையே தொடர்பு கொள்கின்றன.Ig-போன்ற டொமைனின் (பிராந்தியம் 2) பரந்த பக்கங்கள் மிகவும் பாதுகாக்கப்பட்ட Arg மற்றும் அவரது எச்சங்களுடன் நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பள்ளத்தை உருவாக்குகின்றன, மேலும் இந்தப் பகுதிக்கு எதிரான ஆன்டிபாடிகள் முன்பு கேமட் ஃப்யூஷன் 30 ஐத் தடுக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன.ஆன்டிபாடி லீனியர் எபிடோப் 212RIRPAQLTHRGTFS225 ஐ அங்கீகரிக்கிறது, இதில் மூன்று ஆறு அர்ஜினைன் எச்சங்கள் மற்றும் மிகவும் பாதுகாக்கப்பட்ட His220 உள்ளது.செயலிழப்பு இந்த குறிப்பிட்ட எச்சங்கள் அல்லது முழு பகுதியின் அடைப்பு காரணமாக உள்ளதா என்பது தெளிவாக இல்லை.β-சாண்ட்விச்சின் சி-டெர்மினஸுக்கு அருகில் உள்ள இந்த இடைவெளியின் இடம் அண்டை விந்தணு புரதங்களுடன் சிஸ்-இன்டராக்ஷன்களைக் குறிக்கிறது, ஆனால் ஓசைட் புரதங்களுடன் அல்ல.மேலும், கீலுக்குள் மிகவும் நெகிழ்வான புரோலைன் நிறைந்த சிக்கலை (தளம் 3) தக்கவைப்பது புரதம்-புரத தொடர்புகளின் தளமாக இருக்கலாம் அல்லது இரண்டு களங்களுக்கு இடையில் நெகிழ்வுத்தன்மையைத் தக்கவைப்பதைக் குறிக்கலாம்.SPACA6 இன் அறியப்படாத பாத்திரத்திற்கு பாலினம் முக்கியமானது.கேமட்களின் இணைவு.
SPACA6 ஆனது Ig-போன்ற β-சாண்ட்விச்கள் உட்பட இடைச்செல்லுலார் ஒட்டுதல் புரதங்களின் பண்புகளைக் கொண்டுள்ளது.பல பிசின் புரதங்கள் (எ.கா., கேடரின்கள், இண்டக்ரின்கள், அடிசின்கள் மற்றும் IZUMO1) ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட β-சாண்ட்விச் களங்களைக் கொண்டுள்ளன, அவை செல் சவ்வுகளிலிருந்து புரதங்களை அவற்றின் சுற்றுச்சூழல் இலக்குகளுக்கு நீட்டிக்கின்றன63,64,65.SPACA6 இன் Ig-போன்ற டொமைனில் பொதுவாக ஒட்டுதல் மற்றும் ஒத்திசைவின் β-சாண்ட்விச்களில் காணப்படும் ஒரு மையக்கருத்தையும் கொண்டுள்ளது: β-சாண்ட்விச்களின் முனைகளில் உள்ள இணையான இழைகளின் இரட்டைகள், இது மெக்கானிக்கல் கிளாம்ப்ஸ் என்று அழைக்கப்படுகிறது66.இந்த மையக்கருத்து வெட்டு சக்திகளுக்கு எதிர்ப்பை அதிகரிக்கிறது என்று நம்பப்படுகிறது, இது இன்டர்செல்லுலர் தொடர்புகளில் ஈடுபடும் புரதங்களுக்கு மதிப்புமிக்கது.இருப்பினும், அடிசின்களுடன் இந்த ஒற்றுமை இருந்தபோதிலும், SPACA6 முட்டையின் வெள்ளைக்கருவுடன் தொடர்புகொள்வதற்கான எந்த ஆதாரமும் தற்போது இல்லை.SPACA6 எக்டோடோமைன் JUNO உடன் பிணைக்க முடியவில்லை, மேலும் SPACA6-எக்ஸ்பிரஸ்ஸிங் HEK293T செல்கள், இங்கு காட்டப்பட்டுள்ளபடி, zona 32 இல்லாத ஓசைட்டுகளுடன் தொடர்புகொள்வதில்லை.SPACA6 இண்டர்காமெடிக் பிணைப்புகளை நிறுவினால், இந்த இடைவினைகளுக்கு மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய மாற்றங்கள் தேவைப்படலாம் அல்லது பிற விந்தணு புரதங்களால் உறுதிப்படுத்தப்படலாம்.பிந்தைய கருதுகோளுக்கு ஆதரவாக, IZUMO1-குறைபாடுள்ள விந்தணுக்கள் ஓசைட்டுகளுடன் பிணைக்கிறது, IZUMO1 அல்லாத மற்ற மூலக்கூறுகள் கேமட் ஒட்டுதல் படி 27 இல் ஈடுபட்டுள்ளன என்பதை நிரூபிக்கிறது.
பல வைரஸ், செல்லுலார் மற்றும் டெவலப்மென்ட் ஃப்யூஷன் புரோட்டீன்கள் அவற்றின் செயல்பாட்டை ஃபுசோஜென்களாகக் கணிக்கும் பண்புகளைக் கொண்டுள்ளன.எடுத்துக்காட்டாக, வைரஸ் இணைவு கிளைகோபுரோட்டின்கள் (வகுப்புகள் I, II மற்றும் III) புரதத்தின் முடிவில் ஒரு ஹைட்ரோபோபிக் ஃப்யூஷன் பெப்டைட் அல்லது லூப் உள்ளது, இது ஹோஸ்ட் சவ்வுக்குள் செருகப்படுகிறது.IZUMO143 இன் ஹைட்ரோஃபிலிசிட்டி வரைபடம் மற்றும் IST சூப்பர் குடும்பத்தின் அமைப்பு (தீர்மானிக்கப்பட்டது மற்றும் கணிக்கப்பட்டது) வெளிப்படையான ஹைட்ரோபோபிக் ஃப்யூஷன் பெப்டைடைக் காட்டவில்லை.எனவே, IST சூப்பர் குடும்பத்தில் உள்ள ஏதேனும் புரதங்கள் ஃபுசோஜென்களாக செயல்பட்டால், அவை மற்ற அறியப்பட்ட எடுத்துக்காட்டுகளிலிருந்து வேறுபட்ட முறையில் செயல்படுகின்றன.
முடிவில், கேமட் ஃப்யூசனுடன் தொடர்புடைய புரதங்களின் IST சூப்பர்ஃபாமிலியின் உறுப்பினர்களின் செயல்பாடுகள் ஒரு அதிர்ச்சியூட்டும் மர்மமாகவே இருக்கின்றன.எங்களின் வகைப்படுத்தப்பட்ட SPACA6 மறுசீரமைப்பு மூலக்கூறும் அதன் தீர்க்கப்பட்ட அமைப்பும் இந்த பகிரப்பட்ட கட்டமைப்புகளுக்கு இடையிலான உறவுகள் மற்றும் கேமட் இணைப்பு மற்றும் இணைவு ஆகியவற்றில் அவற்றின் பங்கு பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்கும்.
கணிக்கப்பட்ட மனித SPACA6 எக்டோடோமைனுடன் தொடர்புடைய DNA வரிசை (NCBI அணுகல் எண் NP_001303901.1; எச்சங்கள் 27–246) டிரோசோபிலா மெலனோகாஸ்டர் S2 செல்களில் வெளிப்பாட்டிற்காக கோடான்-உகந்ததாக இருந்தது மற்றும் கோடான்-உகந்த முறையில் மரபணு துண்டாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது., BiP சுரப்பு சமிக்ஞை மற்றும் தொடர்புடைய 5′ மற்றும் 3′ முடிவடைகிறது, இந்த மரபணுவின் பிணைப்பு-சுயாதீன குளோனிங் ஒரு pMT வெளிப்பாடு திசையன் அடிப்படையிலான ஒரு மெட்டாலோதியோனின் ஊக்குவிப்பாளரின் அடிப்படையில் ப்யூரோமைசின் (pMT-puro) உடன் தேர்வு செய்ய மாற்றியமைக்கப்பட்டது.pMT-puro திசையன் 10x-His C-terminal tag (படம் S2) ஐத் தொடர்ந்து த்ரோம்பின் பிளவு தளத்தை குறியாக்குகிறது.
SPACA6 pMT-puro திசையன் D. மெலனோகாஸ்டர் S2 (கிப்கோ) கலங்களுக்குள் நிலையான இடமாற்றம் IZUMO1 மற்றும் JUNO43க்கு பயன்படுத்தப்படும் நெறிமுறையைப் போலவே செய்யப்பட்டது.S2 செல்கள் ஷ்னீடரின் ஊடகத்தில் (கிப்கோ) கரைக்கப்பட்டு, 10% (v/v) வெப்ப-செயலாக்கப்படாத கரு கன்று சீரம் (கிப்கோ) மற்றும் 1X ஆன்டிமைகோடிக் ஆண்டிபயாடிக் (கிப்கோ) ஆகியவற்றின் இறுதி செறிவுடன் கூடுதலாக வளர்க்கப்பட்டன.ஆரம்ப பாதை செல்கள் (3.0 x 106 செல்கள்) 6-கிணறு தட்டுகளின் (கார்னிங்) தனிப்பட்ட கிணறுகளில் பூசப்பட்டன.27 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 24 மணிநேரம் அடைகாத்த பிறகு, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி 2 மில்லிகிராம் SPACA6 pMT-புரோ வெக்டார் மற்றும் எஃபெக்டீன் டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் ரியாஜென்ட் (கியாஜென்) ஆகியவற்றின் கலவையுடன் செல்கள் மாற்றப்பட்டன.மாற்றப்பட்ட செல்கள் 72 மணி நேரம் அடைகாத்து பின்னர் 6 மி.கி/மிலி ப்யூரோமைசின் மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டன.பின்னர் செல்கள் முழுமையான ஷ்னீடரின் ஊடகத்திலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டு பெரிய அளவிலான புரத உற்பத்திக்காக சீரம் இல்லாத பூச்சி-எக்ஸ்பிரஸ் ஊடகத்தில் (லோன்சா) வைக்கப்பட்டன.1 L தொகுதி S2 செல் கலாச்சாரம் 8-10 × 106 ml-1 செல்களாக 2 L காற்றோட்டம் உள்ள தட்டையான கீழே உள்ள பாலிப்ரோப்பிலீன் எர்லன்மேயர் குடுவையில் வளர்க்கப்பட்டு, பின்னர் 500 µM CuSO4 (மில்லிபோர் சிக்மா) மற்றும் வடிகட்டப்பட்ட இறுதி செறிவுடன் கருத்தடை செய்யப்பட்டது.தூண்டப்பட்ட.தூண்டப்பட்ட கலாச்சாரங்கள் நான்கு நாட்களுக்கு 120 ஆர்பிஎம்மில் 27° C. வெப்பநிலையில் அடைக்கப்பட்டுள்ளன.
SPACA6 ஐக் கொண்ட நிபந்தனைக்குட்பட்ட ஊடகம் 4°C இல் 5660×g இல் மையவிலக்கு மூலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 10 kDa MWCO சவ்வு கொண்ட சென்ட்ரேமேட் தொடுநிலை ஓட்ட வடிகட்டுதல் அமைப்பு (Pall Corp).SPACA6 கொண்ட செறிவூட்டப்பட்ட ஊடகத்தை 2 மில்லி Ni-NTA அகரோஸ் ரெசின் (கியாஜென்) நெடுவரிசையில் பயன்படுத்தவும்.Ni-NTA பிசின் 10 நெடுவரிசை தொகுதிகள் (CV) தாங்கல் A உடன் கழுவப்பட்டது, பின்னர் 1 CV இன் இடையகமானது 50 mM இன் இறுதி இமிடாசோல் செறிவைக் கொடுக்க சேர்க்கப்பட்டது.SPACA6 ஆனது 10 மில்லி பஃபர் A உடன் இமிடாசோலுடன் 500 mM இறுதி செறிவுடன் சேர்க்கப்பட்டது.ரெஸ்டிரிக்ஷன் கிளாஸ் த்ரோம்பின் (மில்லிபோர் சிக்மா) நேரடியாக டயாலிசிஸ் குழாய்களில் (MWCO 12-14 kDa) ஒரு mg SPACA6க்கு எதிராக 1 அலகுக்கு 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 மற்றும் 150 mM NaCl (பஃபர் பி) டயாலிசிஸுக்கு சேர்க்கப்பட்டது.48 மணிநேரத்திற்கு 4°C இல்.த்ரோம்பின்-கிளீவ்டு SPACA6, உப்பு செறிவைக் குறைக்க மூன்று மடங்கு நீர்த்தப்பட்டு, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 உடன் சமநிலைப்படுத்தப்பட்ட 1 ml MonoS 5/50 GL கேஷன் எக்ஸ்சேஞ்ச் நெடுவரிசையில் (Cytiva/GE) ஏற்றப்பட்டது.கேஷன் எக்ஸ்சேஞ்சர் 3 CV இன் 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 உடன் கழுவப்பட்டது, பின்னர் SPACA6 ஆனது 10 mM Tris-HCl இல் 0 முதல் 500 mM NaCl வரையிலான நேரியல் சாய்வு, 25 CVக்கு pH 7.5 இல் நீக்கப்பட்டது.அயன் பரிமாற்ற குரோமடோகிராஃபிக்குப் பிறகு, SPACA6 1 மில்லிக்கு செறிவூட்டப்பட்டது மற்றும் ஒரு ENrich SEC650 10 x 300 நெடுவரிசையில் (பயோராட்) சமன்படுத்தப்பட்டது B. குரோமடோகிராம், பூல் மற்றும் SPACA6 கொண்ட பின்னங்களின் செறிவூட்டல் படி.16% SDS-பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல்லில் Coomassie-stained electrophoresis மூலம் தூய்மை கட்டுப்படுத்தப்பட்டது.பீர்-லம்பேர்ட் சட்டம் மற்றும் கோட்பாட்டு மோலார் அழிவு குணகம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி 280 nm இல் உறிஞ்சுவதன் மூலம் புரதச் செறிவு அளவிடப்பட்டது.
சுத்திகரிக்கப்பட்ட SPACA6 ஆனது 10 mM சோடியம் பாஸ்பேட், pH 7.4 மற்றும் 150 mM NaF க்கு எதிராக ஒரே இரவில் டயல் செய்யப்பட்டது மற்றும் CD ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கு முன் 0.16 mg/mL க்கு நீர்த்தப்பட்டது.185 முதல் 260 என்எம் அலைநீளம் கொண்ட குறுந்தகடுகளின் ஸ்பெக்ட்ரல் ஸ்கேனிங், ஜாஸ்கோ ஜே-1500 ஸ்பெக்ட்ரோபோலரிமீட்டரில் குவார்ட்ஸ் குவெட்டுகளைப் பயன்படுத்தி 1 மிமீ ஆப்டிகல் பாதை நீளம் (ஹெல்மா) 25 டிகிரி செல்சியஸ் 50 nm/min என்ற விகிதத்தில் சேகரிக்கப்பட்டது.சிடி ஸ்பெக்ட்ரா அடிப்படை சரி செய்யப்பட்டது, சராசரியாக 10 கையகப்படுத்துதல்கள், மற்றும் டிகிரி cm2/dmol இல் எஞ்சிய நீள்வட்டமாக (θMRE) மாற்றப்பட்டது:
MW என்பது Da இல் உள்ள ஒவ்வொரு மாதிரியின் மூலக்கூறு எடை;N என்பது அமினோ அமிலங்களின் எண்ணிக்கை;θ என்பது மில்லி டிகிரிகளில் உள்ள நீள்வட்டம்;d ஆப்டிகல் பாதையின் நீளத்திற்கு செ.மீ.அலகுகளில் புரத செறிவு.