310 10*1மிமீ துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய் இரசாயன கூறு, ஸ்பைட்ராயின் N-முனைய களங்கள் அமிலாய்ட் ஃபைப்ரில்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஹைட்ரஜல்களை உருவாக்குகின்றன மற்றும் புரத அசையாதலுக்கு ஒரு தளத்தை வழங்குகிறது.

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரு ஸ்லைடிற்கு மூன்று கட்டுரைகளைக் காட்டும் ஸ்லைடர்கள்.ஸ்லைடுகளின் வழியாக செல்ல பின் மற்றும் அடுத்த பட்டன்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒவ்வொரு ஸ்லைடையும் நகர்த்த இறுதியில் ஸ்லைடு கன்ட்ரோலர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.

விவரக்குறிப்பு

310 10*1மிமீ துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய் சப்ளையர்கள்

இரசாயன கலவை

இயந்திர பண்புகளை

மறுசீரமைப்பு சிலந்தி பட்டு புரதங்கள் (ஸ்பைடர் சில்க் புரதங்கள்) புதிய உயிரி மூலப்பொருட்களின் வளர்ச்சியில் பல சாத்தியமான பயன்பாடுகளைக் கொண்டுள்ளன, ஆனால் அவற்றின் மல்டிமாடல் மற்றும் திரட்டல்-பாதிப்பு இயல்பு அவற்றைப் பெறுவது கடினம் மற்றும் பயன்படுத்த எளிதானது.மறுசீரமைப்பு மினியேச்சர் ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்கள் மற்றும் முக்கியமாக, N-டெர்மினல் டொமைன் (NT) 37 °C இல் சுய-ஆதரவு மற்றும் வெளிப்படையான ஹைட்ரோஜெல்களை விரைவாக உருவாக்குகிறது என்பதை இங்கே நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம்.NT மற்றும் பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதம் அல்லது பியூரின் நியூக்ளியோசைட் பாஸ்போரிலேஸ் ஆகியவற்றைக் கொண்ட இணைவு புரதங்கள் முழுமையாக செயல்படும் இணைவு புரதங்களை உருவாக்குகின்றன.ஹைட்ரோஜெல்கள்.மறுசீரமைப்பு NT மற்றும் இணைவு புரதங்கள் அதிக வெளிப்பாடு விளைச்சலை வழங்குகின்றன மற்றும் வெளிப்படைத்தன்மை, குறுக்கு இணைப்பு இல்லாமல் ஜெலேஷன் மற்றும் அதிக அடர்த்தியில் செயலில் உள்ள புரதங்களின் நேரடி அசையாமை போன்ற கவர்ச்சிகரமான பண்புகளுடன் ஹைட்ரோஜெல்களை வழங்குகின்றன என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
சிலந்திகளுக்கு ஏழு வெவ்வேறு பட்டு சுரப்பிகள் உள்ளன, ஒவ்வொன்றும் ஒரு குறிப்பிட்ட வகை பட்டுகளை உற்பத்தி செய்கின்றன.அனைத்து ஏழு பட்டு இனங்களும் சிலந்தி பட்டு புரதங்களால் (ஸ்பைட்ராயின்கள்) சுமார் 6000 எச்சங்கள் நீளம் கொண்டவை மற்றும் கோள N- மற்றும் C- முனைய களங்களால் (NT மற்றும் CT) 1,2 சூழப்பட்ட ஒரு பெரிய மைய மறுபகுதியைக் கொண்டிருக்கின்றன.மிகவும் பரவலாக ஆய்வு செய்யப்பட்ட பட்டு வகை, முதன்மை ஆம்புல்லா, முதன்மை ஆம்புல்லா சுரப்பியால் உற்பத்தி செய்யப்படுகிறது.இந்த சுரப்பியில், எபிடெலியல் செல்களின் ஒரு அடுக்கு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களை ஒருங்கிணைத்து சுரப்பியின் லுமினுக்குள் சுரக்கிறது, அங்கு அவை மிக அதிக செறிவுகளில் (30-50% w/v) 3,4 இல் கரையக்கூடிய வடிவத்தில் (டோப்பிங்) இருக்கும்.சுரப்பியில் உள்ள முக்கிய ஆம்புலர் ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களின் அமைப்பு மற்றும் இணக்கம் விவாதிக்கப்பட்டது, ஆனால் பெரும்பாலான சோதனை சான்றுகள் பொதுவாக ஹெலிகல் மற்றும்/அல்லது சீரற்ற ஹெலிகல் இணக்கம் மற்றும் மைக்கேலர் அல்லது லேமல்லர் கட்டமைப்புகள் இருப்பதைக் குறிக்கிறது.மீண்டும் மீண்டும் வரும் களங்கள் பட்டு இழைகளின் இயந்திர பண்புகளை ஒழுங்குபடுத்தும் போது, ​​β-தாள் நானோ கிரிஸ்டல்கள் மற்றும் உருவமற்ற கட்டமைப்புகளை உருவாக்குகின்றனபட்டு உருவாவதைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், 19. டெர்மினல் டொமைன்கள் பரிணாம ரீதியாக பாதுகாக்கப்படுகின்றன மற்றும் அவற்றின் செயல்பாடு அனைத்து ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களுக்கும் பொதுவானதாக இருக்கலாம் 2,20,21.சுரப்பி வழியாக செல்லும் போது, ​​ஸ்பைட்ரோயின் pH சுமார் 7.6 இலிருந்து <5.716 ஆக குறைகிறது மற்றும் படிப்படியாக குறுகலான குழாய் வழியாக இயக்கத்தின் மூலம் வெட்டுதல் மற்றும் நீட்டிப்பு மூலம் அதிகரிக்கிறது.கரைசலில், CT என்பது ஒரு α-ஹெலிகல் கான்ஸ்டிட்யூட்டிவ் பேரலல் டைமர்17, ஆனால் குறைந்த pH மற்றும் வெட்டு விசைகளுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக, CT ஆனது β-லேயர்களை விரித்து மாற்றுகிறது16, 17, β-அடுக்குகளை கன்வெர்ட் 16ன் மீண்டும் மீண்டும் வரும் பகுதிகளில் தூண்டுகிறது. NT என்பது மோனோமெரிக் கீழ் சுரப்பியின் லுமினில் உள்ள நிலைமைகளைப் பிரதிபலிக்கும் நிலைமைகள் மற்றும் ஸ்பைட்ரோயினின் கரைதிறனை மத்தியஸ்தம் செய்கின்றன, ஆனால் pH குறைக்கப்பட்ட நிலையில், பல கார்பாக்சிலிக் அமில பக்கச் சங்கிலிகளின் புரோட்டானேஷன் தோராயமாக 6.5 pKa உடன் NT இன் டைமரைசேஷனுக்கு வழிவகுக்கிறது, இதன் மூலம் NT ஐ நிலைப்படுத்தி ஸ்பைட்ரோயினை பெரிய அளவில் சரிசெய்கிறது. அளவுகள்.நெட்வொர்க்குகள்16,18.இவ்வாறு, இழை உருவாக்கத்தில் NT முக்கியப் பங்கு வகிக்கிறது, பூச்சுகளில் உள்ள மோனோமரில் இருந்து ஃபைபர்23,24,25 இல் ஒரு டைமராக மாறுகிறது.NT ஆனது 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 வரை ஆய்வு செய்யப்பட்ட அனைத்து நிலைகளின் கீழும் மிகவும் கரையக்கூடியதாகவும் ஹெலிகல் ஆகவும் உள்ளது, இது பன்முக புரதங்களின் உற்பத்திக்கான கரைதிறனை மேம்படுத்தும் லேபிளாக அதன் வளர்ச்சிக்கு ஊக்கமளித்தது.
மறுசீரமைப்பு மினி ஸ்பைடர் சில்க் புரதம், ஒரு NT, ஒரு குறுகிய மறு பகுதி, ஒரு CT மற்றும் சுத்திகரிப்புக்கான His6 டேக் (His-NT2RepCT) ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது, இது நேட்டிவ் ஸ்பைடர் பட்டு புரதத்தைப் போலவே நீர்நிலை பஃபரிலும் கரையக்கூடியது மற்றும் பட்டு சிலந்தியின் சொந்த முக்கிய பண்புகளைப் பிரதிபலிக்கிறது. .கவரேஜ் 25.31.பிஹெச் 8 கரையக்கூடிய பூச்சு ஒரு pH 525,32,33,34,35 நீர் குளியல் மூலம் வெளியேற்றப்படும் பயோமிமெடிக் இயந்திரத்தைப் பயன்படுத்தி அவரது-NT2RepCTஐ தொடர்ச்சியான இழைகளாக மாற்ற முடியும்.E. coli இன் உயிரியக்க நொதித்தல் அவரது-NT2RepCT ஐ வெளிப்படுத்துகிறது மற்றும் அதற்குப் பிந்தைய சிகிச்சையின் விளைவாக சுத்திகரிக்கப்பட்ட பிறகு 14 g/L மகசூல் கிடைத்தது.அதிக மகசூல், அதிக கரைதிறன் மற்றும் அமில நிலைகளுக்கு His-NT2RepCT இன் போதுமான பதில் அனைத்தும் NT23, 25, 34 க்குக் காரணம்.
37 °C இல் புரதக் கரைசலை அடைகாப்பதன் மூலம், NT மட்டும் உட்பட, மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களிலிருந்து வெளிப்படையான ஹைட்ரோஜெல்களின் விரைவான உருவாக்கம் குறித்து இங்கு தெரிவிக்கிறோம்.தியோஃப்ளேவின் டி ஃப்ளோரசன்ஸ் (ThT), ஃபோரியர் டிரான்ஸ்ஃபார்ம் இன்ஃப்ராரெட் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (FTIR), நியூக்ளியர் மேக்னடிக் ரெசோனன்ஸ் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (NMR) மற்றும் டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, NT மற்றும் மைக்ரோஸ்பைடர் புரோட்டீன்கள் β-like fifrils-sheets மற்றும் amylls-sheets ஆக கட்டமைப்பு ரீதியாக மாற்றப்படுவதைக் கண்டறிந்தோம். ஜெல் உருவாகும் போது.கூடுதலாக, NT மற்றும் பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதம் (GFP) அல்லது ப்யூரின் நியூக்ளியோசைட் பாஸ்போரிலேஸ் (PNP) ஆகியவற்றின் இணைவு புரதங்கள் முழுமையாக செயல்படும் இணைவு துண்டுகளுடன் ஹைட்ரஜல்களை உருவாக்குகின்றன.உடலியல் நிலைமைகளின் கீழ் ஹைட்ரோஜெல்களின் விரைவான உருவாக்கத்துடன் இணைந்த பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த ஹோஸ்ட்களில் உயர்-செயல்திறன் வெளிப்பாடு, பொறிக்கப்பட்ட செயல்பாடுகளுடன் ஹைட்ரஜல்களின் செலவு குறைந்த உற்பத்திக்கான வாய்ப்பைத் திறக்கிறது.
பெரும்பாலான அறிக்கையிடப்பட்ட மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களைப் போலல்லாமல், அவரது-NT2RepCT ஆனது டிரிஸ்-எச்.சி.எல் பஃபரில் pH 8 இல் நிலையானது மற்றும் மழைப்பொழிவு இல்லாமல் 500 mg/mL வரை செறிவூட்டப்படலாம்25.எனவே, இந்த புரதம் 37°C (படம் 1b-d) இல் அடைகாக்கும் போது ஒளியியல் தெளிவான, சுய-ஆதரவு ஹைட்ரஜல்களை விரைவாக உருவாக்குவதைக் கண்டு நாங்கள் ஆச்சரியப்பட்டோம்.மேலதிக ஆய்வுகள், His-NT2RepCT ஜெலேஷன் பரந்த அளவிலான புரதச் செறிவுகளில் (10-300 mg/mL) நிகழ்ந்தது என்றும், இந்த செறிவு ஜெலேஷன் நேரத்துடன் நேர்மாறாக தொடர்புள்ளது என்றும் காட்டியது (படம். 1c மற்றும் துணைப் படம். 1).His-NT2RepCT யின் எந்தப் பகுதிகள் ஹைட்ரஜல் உருவாக்கத்தை மத்தியஸ்தம் செய்கின்றன என்பதைக் கண்டறிய, ஒவ்வொரு டொமைனையும் தனித்தனியாகவும் பல்வேறு சேர்க்கைகளிலும் ஒரு பிளாஸ்க் தலைகீழ் மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்தோம் (படம் 1a,b).மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் அனைத்து சோதனை பின்னங்களும் 1 மணிநேரத்திற்கும் குறைவான நேரத்தில் ஜெல்களை (300 மி.கி./மி.லி புரதச் செறிவில்) உருவாக்கியது, வேகமான 2ரெப் (படம். 1 பி) தவிர.NT மற்றும் CT மட்டும், இணைந்து அல்லது மறுநிகழ்வுகளுடன் தொடர்புடையது, 37°C இல் ஜெல் செய்ய முடியும் என்றும் His6 குறிச்சொல் இந்த செயல்முறையை குறிப்பிடத்தக்க அளவிற்கு பாதிக்காது என்றும் இது அறிவுறுத்துகிறது.NT மிகவும் கரையக்கூடிய மற்றும் நிலையான புரதம் என்ற பொதுவான கருத்தைக் கொண்டு, ஸ்பைட்ரோயின் ஹைட்ரோஜெல்களின் முந்தைய அறிக்கைகள் மீண்டும் மீண்டும் பகுதிகள் மற்றும்/அல்லது CT களில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கு ஜெலேஷன் விளைவுகளைக் காரணமாகக் கூறுகின்றன.ஜெலேஷன் கண்டுபிடிப்பு எதிர்பாராதது.துணை அட்டவணை 1) 37, 38, 39. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், NT ஏற்கனவே 10 நிமிடங்களுக்குள் ≥ 300 mg/mL (படம் 1c) என்ற செறிவில் ஜெல் செய்யப்பட்டது.NT இன் பல்வேறு செறிவுகளைக் கொண்ட குப்பி தலைகீழ் சோதனைகள்>50 mg/mL இல் NT கரைசல், தொடர்புடைய செறிவில் His-NT2RepCT ஐ விட வேகமாக ஜெல் செய்யப்பட்டது என்பதைக் காட்டுகிறது (w/v, படம் 1c).
இந்த வேலையில் ஆய்வு செய்யப்பட்ட பல்வேறு ஸ்பைட்ரோயின் கட்டுமானங்களின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்.b குப்பியை கவிழ்ப்பதன் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்ட பல்வேறு மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களுக்கு (300 mg/mL) 37 °C ஜெல் நேரம்.CT ஜெல் அடைகாக்காமல் உடனடியாக (<300 mg/mL), 2Rep படிவுகள் (300 mg/mL, 5 mm அளவு).c ஹிஸ்-என்டி2ரெப்சிடி மற்றும் என்டியின் ஜெல் நேரம் 37 டிகிரி செல்சியஸ் இல் குறிப்பிடப்பட்ட புரதச் செறிவுகளில்.d சிலந்தியுடன் கூடிய His-NT2RepCT மற்றும் NT ஹைட்ரோஜெல்களின் புகைப்படங்கள் மற்றும் "NT" எழுத்து முறையே கீழே அச்சிடப்பட்டுள்ளது (இரண்டும் 200 mg/mL, அளவுகோல் 5 மிமீ).
பல்வேறு மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களால் உருவாகும் ஹைட்ரோஜெல்கள் சற்று மாறுபட்ட நிறங்களைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் நிர்வாணக் கண் பார்வையானது மாறுபட்ட அளவிலான வெளிப்படைத்தன்மையைக் காட்டுகிறது (படம் 1 பி).NT ஜெல்கள் விதிவிலக்காக தெளிவாக இருக்கும் போது மற்ற ஜெல்கள் ஒளிபுகாதாக மாறும்.அவரது-NT2RepCT மற்றும் NT ஜெல்களை உருளைக் குழாய்களில் போடுவது அச்சில் இருந்து அப்படியே அகற்றப்படலாம் (படம் 1d).
இயற்கையான சிலந்திப் பட்டுப் பூச்சுகள் இப்போது மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களின் ஜெலேஷன் ஏற்படுவதற்குக் காரணமா என்பதைச் சோதிக்க, ஸ்வீடிஷ் பிரிட்ஜ் ஸ்பைடரின் (லாரினியோய்ட்ஸ் ஸ்க்லோபெடாரியஸ்) பெரிய ஆம்புல்லா சுரப்பியில் இருந்து பூச்சுகள் சேகரிக்கப்பட்டன.பூச்சுகள் 20 mM Tris-HCl பஃபரில் 50 mg/mL (அளக்கப்பட்ட உலர் எடையின் அடிப்படையில்) சேமிக்கப்பட்டன, ஆனால் 37 °C இல் 21 நாள் அடைகாக்கும் போது எந்த ஜெலேஷன் காணப்படவில்லை (துணை படம் 2a).
இந்த ஜெல்களை அளவிட, வானியல் அளவீடுகள் ஜெலேஷன் செயல்முறையைப் படிக்கவும் ஒட்டுமொத்த இயந்திர பண்புகளை தீர்மானிக்கவும் பயன்படுத்தப்படலாம்.குறிப்பாக, உயர்ந்த வெப்பநிலையில் சேமிப்பக மாடுலஸ் (நெகிழ்ச்சி) கண்காணிப்பது ஜெல்லிங் வெப்பநிலை மற்றும் பூச்சுகளின் விஸ்கோலாஸ்டிக் பண்புகள் பற்றிய தகவலை வழங்க முடியும்.வெப்பநிலை உயர்வு சோதனைகள் (இயற்கையான பட்டு இருப்பு கரைசல்களைப் பயன்படுத்தி முந்தைய ஆய்வுகளின் அடிப்படையில் 25-45 ° C இல் 1°C/நிமிடத்தைப் பயன்படுத்துதல்) 40,41, அதிகரிக்கும் வெப்பநிலையுடன் His-NT2RepCT மற்றும் NT கரைசல்களின் சேமிப்பு அளவு அதிகரித்ததைக் காட்டுகிறது.அதிகரிக்கப்பட்டது (படம் 2 மற்றும் துணை படம் 3).குறிப்பிடத்தக்க வகையில், NT தொகுதி அவரது-NT2RepCT உடன் ஒப்பிடும்போது குறைந்த வெப்பநிலையில் வளரத் தொடங்கியது, NT நேரடியாக His-NT2RepCT உடன் 37°C (படம் 1) இல் அடைகாக்கப்பட்ட போது காணப்பட்ட வேகமான ஜெல் நேரத்துடன் ஒத்துப்போகிறது.வெப்பநிலையில் அடுத்தடுத்த வீழ்ச்சிக்குப் பிறகு, சேமிப்பக மாடுலஸ் குறைந்த மதிப்புகளுக்குத் திரும்பவில்லை மற்றும் இழப்பு மாடுலஸுக்கு மேலே இருந்தது (துணை படம் 3 ஐப் பார்க்கவும்), இது வெப்ப ரீதியாக மீளமுடியாத நிலையான ஜெலேஷன் என்பதைக் குறிக்கிறது.100-500 mg/mL செறிவில் His-NT2RepCT ஹைட்ரோஜெல்களுக்கு இறுதி மீள் மாடுலஸ் 15 முதல் 330 kPa வரை இருந்தது, மேலும் NT ஹைட்ரஜல்களுக்கான (100–500 mg/mL) இறுதி மீள் மாடுலஸ் 2 முதல் 14000 வரை இருந்தது. kPa (படம், 2 மற்றும் முழுமையான வளைவுத் தரவு) துணை படம் 3 ஐப் பார்க்கவும்.
அவரது-NT2RepCT (300 mg/mL) மற்றும் b NT (300 mg/mL) ஆகியவற்றின் அளவீடுகளின் போது வெப்பநிலையில் மாற்றம்.அம்புகள் வெப்பநிலை போக்கைக் குறிக்கின்றன, மேலும் சேமிப்பக தொகுதி தரவுகளின் இலகுவான நிழல் உற்பத்தியாளரால் குறிப்பிடப்பட்டதை விட குறைந்த முறுக்கு மதிப்புகளில் கருவிக்கான சோதனையை சித்தரிக்கிறது, இது அதிகரித்த சத்தத்திற்கு காரணமாகும்.c உயர்ந்த வெப்பநிலை (100, 300, மற்றும் 500 mg/mL) பிறகு His-NT2RepCT மற்றும் NT இன் எண்ட்-மாட்யூல் குவிப்பு.அனைத்து தொகுதி அளவீடுகளும் 0.1 ஹெர்ட்ஸ் அதிர்வெண்ணில் எடுக்கப்படுகின்றன.
ஜெலேஷன் உடன் தொடர்புடைய மாற்றங்களை ஆராய்வதற்கான சாத்தியமான முறையாக, 37°C (படம் 3a,b) இல் ஜெலேஷன் செய்வதற்கு முன்னும் பின்னும் His-NT2RepCT மற்றும் NT இன் FTIR ஸ்பெக்ட்ராவைப் பதிவு செய்தோம்.எதிர்பார்த்தபடி, His-NT2RepCT மற்றும் NT தீர்வுகளின் நிறமாலையானது α-ஹெலிக்ஸ்/ரேண்டம் சுருள் இரண்டாம் கட்டமைப்பைக் காட்டும் புரதங்களுடன் ஒத்திருந்தது, 1645 cm-1 இல் உச்சரிக்கப்படும் பட்டையுடன்.இரண்டு ஹைட்ரோஜெல்களுக்கும், ஜெலேஷன் ஆனது நடு I பேண்டில் சுமார் 1617 cm-1 மற்றும் 1695 cm-1 (படம் 3a, b) இல் இரண்டு கைகளை உருவாக்கியது.இந்த மாற்றங்களை அந்தந்த இரண்டாவது வழித்தோன்றல் மற்றும் வேறுபாடு ஜெலேஷன் ஸ்பெக்ட்ராவிலும் தெளிவாகக் காணலாம் (துணை படம். 4b).NT β-லேயரின் இரண்டு பட்டைகள் His-NT2RepCTஐ விட அதிகமாக உச்சரிக்கப்பட்டது, NT ஹைட்ரஜலில் உள்ள β-லேயர் பட்டைகளின் மொத்த உள்ளடக்கம் NT2RepCT ஹைட்ரஜலை விட அதிகமாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது.
ஒரு FTIR உறிஞ்சுதல் நிறமாலை His-NT2RepCT மற்றும் b NT (இரண்டும் 500 mg/mL) முன் (தீர்வு) மற்றும் பிறகு (ஜெல்) 37 ° C இல் அடைகாக்கும்.c TEM படங்கள் மீண்டும் இணைக்கப்பட்ட 50 mg/ml NT2RepCT ஜெல் மற்றும் d NT.அளவுகோல் 200 nm.அவரது-NT2RepCT மற்றும் NT ஹைட்ரோஜெல்களின் e ஃபைபர் விட்டம்.n = 100 அளவிடப்பட்ட இழைகள், ப <0.0001.பிழை பார்கள் நிலையான விலகலைக் காட்டுகின்றன.பிழை பட்டைகளின் மையம் சராசரி.புள்ளியியல் பகுப்பாய்விற்கு இணைக்கப்படாத டி-டெஸ்ட் (இரண்டு-வால்) பயன்படுத்தப்பட்டது.f பல்வேறு மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களின் (100 mg/mL) 37 °C இல் குலுக்காமல் ThT ஃப்ளோரசன்ஸ்.0%, 5%, 10% மற்றும் 20% விதைகள் கொண்ட 100 mg/mL NT ஜெல்லில் இருந்து g NT (100 mg/mL) தடுப்பூசி பரிசோதனைகள்.
டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) ஐப் பயன்படுத்தி ஜெல்லின் பகுப்பாய்வு, ஹைட்ரஜல் அமிலாய்டு போன்ற ஃபைப்ரில்களைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம். 3c, 3d).NT-உருவாக்கப்பட்ட ஃபைப்ரில்கள் நீளமானவை (5-12 nm விட்டம்) மற்றும் கிளைகள் இல்லாதவை, அதே சமயம் His-NT2RepCT ஃபைப்ரில்கள் நீளம் குறைவாகவும், விட்டம் (7-16 nm) கணிசமாக அகலமாகவும் இருந்தன (படம் 3e).இந்த முடிவுகள் தியோஃப்ளேவின் டி (ThT) மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்தி ஃபைப்ரோஸிஸின் இயக்கவியலைப் பின்பற்ற அனுமதித்தன.அனைத்து மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களுக்கும், மாதிரிகள் 37 °C இல் அடைகாக்கும் போது ஒளிரும் சமிக்ஞை அதிகரித்தது (படம். 3f, துணைப் படம். 5a).இந்த கண்டுபிடிப்புக்கு இணங்க, ஜெல்லிங் நிலைமைகளின் கீழ் NT மற்றும் His-NT2RepCT இன் நுண்ணிய ஆய்வு, ThT-பாசிட்டிவ் மொத்தங்களின் குறிப்பிடத்தக்க உள்ளூர் திரட்சியின்றி ThT ஃப்ளோரசன்ஸில் சீரான அதிகரிப்பை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம். 5b,c).ThT-பாசிட்டிவ் ஃபைப்ரில்களின் உருவாக்கம் NT மற்றும் His-NTCT டர்பிடிட்டி (துணை படம். 5d) அதிகரிப்புடன் இல்லை, அதாவது ஜெல்லில் உள்ள ஃபைப்ரில்களின் நெட்வொர்க் ஜெல் தெளிவை சமரசம் செய்யாமல் உருவாக்க முடியும்.சிறிய அளவிலான முன்-உருவாக்கப்பட்ட ஃபைப்ரில்களை சேர்ப்பதன் மூலம் விதைப்பது சில அமிலாய்டுகளின் ஃபைப்ரில் உருவாவதை கணிசமாக துரிதப்படுத்தலாம், ஆனால் 5%, 10% அல்லது 20% (w/w) NT ஐ NT ஹைட்ரோகோகுலண்டுகளின் கரைசலில் சேர்ப்பது.விதைப்பு விளைவு (படம் 3g).ஹைட்ரஜலில் உள்ள ஃபைப்ரில்கள் ஒப்பீட்டளவில் நிலையானவை மற்றும் விதைகளாகப் பயன்படுத்த முடியாதது இதற்குக் காரணமாக இருக்கலாம்.
உயர் வெப்பநிலையில் மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களின் எதிர்பாராத நடத்தை, ஜெல் உருவாக்கத்துடன் தொடர்புடைய மாற்றங்களை அடையாளம் காண அணு காந்த அதிர்வு (NMR) ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி ஆய்வுகளை மேலும் தூண்டியது.37°C இல் காலப்போக்கில் பதிவுசெய்யப்பட்ட His-NT2RepCT தீர்வுகளின் NMR ஸ்பெக்ட்ரா, CT இன்னும் ஓரளவு மடிந்திருப்பதைக் காட்டியது, அதேசமயம் NT மற்றும் 2Rep சிக்னல்கள் மறைந்துவிட்டன (படம். 4a), இது முக்கியமாக NT மற்றும் 2Rep ஆகும் என்று கூறுகிறது. NT2RepCT ஹைட்ரஜல்.CT சிக்னல் அதன் அசல் தீவிரத்தில் 20% ஆகக் குறைக்கப்பட்டது, இது CT ஆனது பெரும்பாலும் நிலையானது மற்றும் ஹைட்ரஜல் கட்டமைப்பில் இணைக்கப்பட்டுள்ளது.CT இன் ஒரு சிறிய பகுதிக்கு, முன்னரே அடைக்கப்பட்ட மாதிரியைப் போலவே மொபைல் மற்றும் NMR தீர்வு மூலம் கவனிக்கப்படுகிறது, ஸ்பெக்ட்ராவில் முதல் 10 கட்டமைக்கப்பட்ட எச்சங்களுக்கு சிக்னல்கள் இல்லை, ஒருவேளை His-NT2Rep இன் இணைக்கப்பட்ட பகுதியின் கடினமான அசையாமை காரணமாக இருக்கலாம்.ஹைட்ரோஜெல்களின் -NT2RepCT இன் NMR ஸ்பெக்ட்ரா, α-ஹெலிஸ்கள் மற்றும் β-அடுக்குகளின் முக்கிய இருப்பை வெளிப்படுத்தியது மற்றும் குறைந்த அளவிற்கு, சீரற்ற சுருள் இணக்கம் (படம். 4b).NT இல் மட்டுமே இருக்கும் மெத்தியோனைன் எச்சங்களின் இரசாயன மாற்ற பகுப்பாய்வு, இந்த டொமைன் β-தாள் அமைப்பாக மாற்றப்பட்டிருப்பதைக் காட்டுகிறது.கரைசலில் உள்ள NTயின் நேரத்தைச் சார்ந்த நிறமாலையானது சிக்னல் தீவிரத்தில் ஒரு சீரான குறைவைக் காட்டியது (படம். 4c), மேலும் NT ஹைட்ரோஜெல்களின் திட-நிலை NMR, பெரும்பாலான NT எச்சங்கள் β-தாள் கட்டமைப்புகளாக மாற்றப்பட்டதைக் காட்டியது (படம். 4d).2Rep இன் ஒருங்கிணைப்பை அதன் ஒருங்கிணைப்பு போக்கு காரணமாக தனித்தனியாக தீர்மானிக்க முடியவில்லை.இருப்பினும், NTCT மற்றும் His-NT2RepCT ஹைட்ரோஜெல்களின் திட நிலை NMR ஸ்பெக்ட்ரா மிகவும் ஒத்ததாக இருந்தது (படம். 4b; துணை படம். 6b), அவரது-NT2RepCT ஹைட்ரஜலின் கட்டமைப்பு பகுதிக்கு 2Rep சிறிதளவு பங்களிப்பதாகக் கூறுகிறது.CT ஹைட்ரோஜெல்களுக்கு, α-ஹெலிஸ்கள், β-தாள்கள் மற்றும் சீரற்ற ஹெலிகல் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகள் இருப்பது கண்டறியப்பட்டது (துணை படம். 6d).CT இன் சில பகுதிகள் α-ஹெலிகளாக இருக்கும், மற்றவை β-தாள்களாக மாறுகின்றன என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.எனவே, என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபியின் முடிவுகள், ஹைட்ரஜல் உருவாவதற்கு NT முக்கியமானது என்றும், 2Rep மற்றும் CT உடன் இணைவதன் மூலம் β-தாள் இணக்கமாகவும் மாறுகிறது என்றும் தெரிவிக்கிறது.இதற்கு இணங்க, NT டொமைனின் அனைத்து ஐந்து ஹெலிக்களிலும் அமிலாய்ட் ஸ்பேஷியல் ஜிப்பர்கள் உருவாகலாம் என்பதை நாங்கள் சமீபத்தில் கண்டறிந்தோம், மேலும் வால்ட்ஸ் அல்காரிதம் ஹெலிக்ஸ் 1 இல் ஒரு அமிலாய்டோஜெனிக் பகுதியைக் கணித்துள்ளது (படம் 4e).
2D நிறமாலை 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT கரைசல் முன் (நீலம்) மற்றும் 19 மணிநேரம் அடைகாத்த பிறகு (சிவப்பு) 37°C.சிவப்பு நிறமாலையில் உள்ள தனிப்பட்ட குறுக்கு சிகரங்கள் மற்றும் நீல நிறமாலையில் F24, G136, polyA ஆகியவை ஒற்றை எழுத்து அமினோ அமில குறியீடுகள் மற்றும் எச்ச எண்களால் குறிக்கப்படுகின்றன.NT, 2Rep மற்றும் CT டொமைன்களில் இருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட எச்சங்களுக்கான சமிக்ஞை தீவிரத்தை நேரத்தின் மீது சார்ந்திருப்பதை இன்செட்டுகள் காட்டுகின்றன.b His-NT2RepCT ஹைட்ரோஜெல்களின் திட-நிலை கதிரியக்க அதிர்வெண் (RFDR) நிறமாலை.RFDR நிறமாலையில் காணப்பட்ட Cα/Cβ எச்சங்களின் தொடர்புகள் மாதிரி பெப்டைட் இரசாயன மாற்றங்கள் மற்றும் புள்ளிவிவரங்கள்82,83 மற்றும் அவற்றின் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளிலிருந்து பெறப்பட்ட மதிப்புகள் ஆகியவற்றுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.SSB - சுழலும் பக்கப்பட்டி.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT கரைசலின் ஒரு பரிமாண நிறமாலை 36 மணிநேரத்திற்கு 37 °C இல் அடைகாக்கும் போது.இன்செட் வால்யூமெட்ரிக் தீவிரம் மற்றும் நேரம் ஆகியவற்றைக் காட்டுகிறது.d திட நிலை RFDR நிறமாலை NT ஹைட்ரோஜெல்ஸ்.RFDR நிறமாலையில் காணப்பட்ட Cα/Cβ எச்சங்கள் மற்றும் அவற்றின் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளின் தொடர்புகள் சுட்டிக்காட்டப்படுகின்றன.e ஜிப்பர் தரவுத்தளத்திலிருந்து (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 ஃபைப்ரிலேஷன் சார்பு சுயவிவரத்தின் அடிப்படையில்.ஹெக்ஸாபெப்டைட்டின் இடஞ்சார்ந்த மின்னல் மாற்ற சாளரத்தின் ரொசெட்டா ஆற்றல் kcal/mol இல் காட்டப்பட்டுள்ளது.சிவப்பு பட்டைகள் ஹெக்ஸாபெப்டைடுகளை அதிக ஃபைப்ரோஸிஸ் நாட்டம் கொண்டவை (Rosetta ஆற்றல் கீழே -23 kcal/mol; புள்ளியிடப்பட்ட கோட்டிற்கு கீழே).பச்சைப் பட்டைகள் வாசலுக்கு மேலே ரொசெட்டா ஆற்றல்களைக் கொண்ட துண்டுகளைக் குறிக்கின்றன, எனவே ஸ்டெரிக் சிப்பர்களை உருவாக்குவதற்கான வாய்ப்புகள் குறைவு.புரோலைன் கொண்ட துண்டுகள் பகுப்பாய்விலிருந்து விலக்கப்பட்டன (நெடுவரிசைகள் இல்லாமல்).வால்ட்ஸ் அல்காரிதம்81 (https://waltz.switchlab.org) மூலம் கணிக்கப்படும் அமிலாய்டோசிஸ் பகுதிகளை சதுரங்கள் குறிப்பிடுகின்றன.NT இன் அமினோ அமில எச்சங்களின் வரிசை மேலே உள்ளது, மேலும் β இரண்டாம் கட்டமைப்பில் காணப்படும் எச்சங்களின் வகைகள் (திட-நிலை NMR ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி மூலம் தீர்மானிக்கப்படுகிறது) சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.ஐந்து NT α-ஹெலிகளின் நிலைகள் (H1-H5)28 என குறிப்பிடப்பட்டுள்ளன.
pH <6.5 இல், HT இருமடைகிறது, வெப்பம்- அல்லது யூரியா-தூண்டப்பட்ட டீனாடரேஷனை எதிர்க்கும்18.NT டைமரைசேஷன் மற்றும் ஸ்திரத்தன்மை ஜெலேஷன் மீது எவ்வாறு தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது என்பதை தெளிவுபடுத்த, 100 mg/ml NT கொண்ட தீர்வுகள் pH 8, 7 மற்றும் 6 இல் குப்பியை தலைகீழ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி கட்டுப்படுத்தப்பட்டன.NT மாதிரிகள் pH 8 மற்றும் 7 இல் அடைகாக்கப்பட்ட 30 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு 37 °C இல் ஜெல் செய்யப்பட்டது, ஆனால் pH 8 ஜெல் தெளிவாக இருந்தது, அதே நேரத்தில் pH 7 ஜெல் காணக்கூடிய வீழ்படிவைக் காட்டியது (படம் 5a).இதற்கு நேர்மாறாக, pH 6 இல் HT ஐக் கொண்ட ஒரு தீர்வு ஒரு ஜெல்லை உருவாக்கவில்லை, மேலும் 20 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு 37 ° C இல் ஒரு பெரிய வீழ்படிவைக் காணலாம்.மோனோமர்களுடன் ஒப்பிடும்போது டைமர்கள் மற்றும்/அல்லது அவற்றின் உயர் நிலைத்தன்மை ஜெலேஷன் தடுக்கிறது என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.200 mg/ml27 இல் NT கரையக்கூடியது, வெப்பக் குறைபாட்டிற்குப் பிறகு எளிதில் மடிகிறது, மேலும் குறைந்த மதிப்புகளில் α-ஹெலிக்ஸைத் தக்கவைத்துக் கொள்கிறது என்று தெரிவிக்கப்பட்டதால், pH 7 மற்றும் 6 இல் NT க்கு ஒரு வீழ்படிவு உருவாகும் என்று எதிர்பார்க்கப்படவில்லை. pH 18. இந்த முரண்பாடுகளுக்கான சாத்தியமான விளக்கம் என்னவென்றால், முன்பு அறிக்கையிடப்பட்ட சோதனைகள் அறை வெப்பநிலையில் அல்லது அதற்குக் கீழே அல்லது ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த புரதச் செறிவுகள்16,18,19 இல் மேற்கொள்ளப்பட்டன.
37°C இல் அடைகாத்த பிறகு pH 8, 7, 6 மற்றும் 154 mM NaCl (pH 8) இல் NT குப்பியின் தலைகீழ் சோதனை (100 mg/mL).b NT CD ஸ்பெக்ட்ரா முறையே 154 mM NaF மற்றும் 154 mM NaCl உடன் மற்றும் இல்லாமல்.222 nm இல் உள்ள மோலார் நீள்வட்டம் இயற்கை மடிப்புகளின் விகிதமாக மாற்றப்படுகிறது.c NT தலைகீழ் மதிப்பீடு (100 mg/mL) NT* (37 °C மற்றும் 60 °C), NTA72R (37 °C), மற்றும் His-NT-L6 (37 °C மற்றும் 60 °C).d NT மரபுபிறழ்ந்த NT*, NTA72R மற்றும் His-NT-L6 ஆகியவற்றின் குறுவட்டு நிறமாலை.222 nm இல் உள்ள மோலார் நீள்வட்டம் இயற்கை மடிப்புகளின் விகிதமாக மாற்றப்படுகிறது.e NTFlSp, NTMiSp மற்றும் குறைக்கப்பட்ட NTMiSp (100 mg/mL) இன் இன்வெர்ஷன் சோதனை.அளவுகோல் 5 மிமீ.f CD ஸ்பெக்ட்ரா NT, NTFlSp, NTMiSp மற்றும் குறைக்கப்பட்ட NTMiSp.222 nm இல் உள்ள மோலார் நீள்வட்டம் இயற்கை மடிப்புகளின் விகிதமாக மாற்றப்படுகிறது.25 °C மற்றும் 95 °C இல் முழு NT ஸ்பெக்ட்ரா துணை படம் 8 இல் காட்டப்பட்டுள்ளது.
உடலியல் உப்பு செறிவு NT துணைக்குழுக்கள் மற்றும் குறைந்த pH18 க்கு NT பரிமாற்றத்தின் டைமரைசேஷன் இடையே மின்னியல் தொடர்புகளை தீர்மானிக்கிறது.154 mM NaCl மற்றும் NaF ஆகியவை முறையே ஜெலேஷன் செய்வதைத் தடுக்கின்றன என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம். 5a, b; துணைப் படம். 2b) மேலும் இந்த உப்புகள் NT மோனோமர்களின் வெப்ப நிலைத்தன்மையை அதிகரித்தன (படம். 5b, துணைப் படம். 8) .டைமரைசேஷனை விட நிலைத்தன்மை மேம்பாடு ஜெல் உருவாவதைத் தடுக்கிறது என்றும் இது அறிவுறுத்துகிறது.
ஜிலேஷனில் புரோட்டீன் டைமரைசேஷன் மற்றும் ஸ்திரத்தன்மையின் பங்கை மேலும் ஆராய, NT* மற்றும் NTA72R ஆகிய இரண்டு மரபுபிறழ்ந்தவர்களைப் பயன்படுத்தினோம், அவை குறைந்த pH28.30 இல் மோனோமெரிக் ஆக இருக்கும்.NT* என்பது இரட்டை மின்னூட்டம் தலைகீழ் விகாரமாகும், இதில் மோனோமரின் வெளிப்படையான இருமுனை சார்ஜ் விநியோகம் தட்டையானது, இது டைமரைசேஷனைத் தடுக்கிறது மற்றும் மோனோமர் நிலைத்தன்மையை கடுமையாக அதிகரிக்கிறது.NTA72R என்பது சார்ஜ் செய்யப்பட்ட இருமுனையாகும், ஆனால் Arg-பதிலீடு செய்யப்பட்ட ஆலா டைமர் எல்லையில் அமைந்துள்ளது, எனவே பிறழ்வுகள் டைமரைசேஷனுக்குத் தேவையான துணைக்குழு இடைவினைகளில் தலையிடுகின்றன.37°C இல் அடைகாக்கும் போது, ​​NT* ஒரு ஹைட்ரஜலை உருவாக்கவில்லை, NTA72R ஆனது 15 நிமிடங்களுக்கு ஒரு ஒளிபுகா ஜெல்லை உருவாக்கியது (படம் 5c).NT* மற்றும் NTA72R இரண்டும் டைமரைஸ் செய்ய முடியாது ஆனால் மோனோமர் நிலைத்தன்மையில் வேறுபடுகின்றன (படம். 5d), இந்த முடிவுகள் உயர் வெப்ப இயக்கவியல் நிலைத்தன்மை NT ஐ ஜெல்லிங் செய்வதைத் தடுக்கிறது என்று உறுதியாகக் கூறுகின்றன.உயர் வெப்பநிலையில் நிலையற்றதாக இருக்கும் போது HT* ஒரு ஜெல் உருவாக்குகிறது (60°C இல் 8 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு; படம் 5c).NT இல் உள்ள மெத்தியோனைனின் அதிக உள்ளடக்கம் அதன் இயற்கையான மடிப்புகளை திரவமாக்குகிறது மற்றும் ஆறு Met to Leu மாற்றீடுகள் (His-NT-L6 என இங்கு குறிப்பிடப்படுகிறது) NT46 மோனோமரை வலுவாக உறுதிப்படுத்துகிறது என்று முன்பு காட்டப்பட்டது.NT ஜெல் உருவாக்கத்திற்கு கட்டமைப்பு நெகிழ்வுத்தன்மை தேவை என்ற அனுமானத்தின் அடிப்படையில், His-NT-L6 நிலையான விகாரி 37 °C இல் ஜெல் செய்யவில்லை என்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 5c, d).இருப்பினும், ஹிஸ்-என்டி-எல்6 60 நிமிடங்களுக்கு 60 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரு ஜெல்லை உருவாக்கியது (படம் 5 சி).
NT-யின் திறன் β-ஷீட் கட்டமைப்புகளாகவும், ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்கவும், ஸ்பைட்ரோயினின் அனைத்து NT டொமைன்களுக்கும் பொருந்தாது.வெவ்வேறு பட்டு வகைகள் மற்றும் சிலந்தி இனங்கள், டிரிகோனெபிலா கிளாவிப்ஸ் (NTFlSp) ஆகியவற்றிலிருந்து NTகள், அவற்றின் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த மெத்தியோனைன் உள்ளடக்கம் மற்றும் அதிக வெப்ப நிலைத்தன்மை (படம். 5e, f மற்றும் துணை அட்டவணை 2) இருந்தபோதிலும் ஜெல்களை உருவாக்குகின்றன.இதற்கு நேர்மாறாக, குறைந்த வெப்ப நிலைப்புத்தன்மை மற்றும் அதிக மெத்தியோனைன் உள்ளடக்கம் கொண்ட அரேனியஸ் வென்ட்ரிகோசஸ் (NTMiSp) இலிருந்து சிறிய ஆம்புலர் புரதம் ஸ்பைட்ரோயினில் இருந்து NT ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்கவில்லை (துணை அட்டவணை 2 மற்றும் படம். 5e, f).பிந்தையது இன்ட்ராமாலிகுலர் டைசல்பைட் பிணைப்புகள் 29,47 இருப்புடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.தொடர்ந்து, NTMiSp இன் டைசல்பைட் பிணைப்புகள் குறைக்கப்பட்டபோது, ​​அது 10 நிமிடங்களுக்கு 37 ° C இல் அடைகாத்த பிறகு ஒரு ஹைட்ரஜலை உருவாக்கியது (படம் 5e).முடிவில், NT இலிருந்து ஒரு ஜெல் உருவாவதற்கு கட்டமைப்பு நெகிழ்வுத்தன்மை ஒரு முக்கியமான, ஆனால் ஒரே அளவுகோல் அல்ல என்பதை கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்களை உருவாக்கும் முனைப்பும், ஜிப்பர் தரவுத்தளம் மற்றும் வால்ட்ஸ் அல்காரிதம் ஆகியவற்றுடனான பகுப்பாய்வு, ஜெல்களை உருவாக்கும் திறனுக்கும் அமிலாய்டோஜெனிக் பகுதிகளின் இருப்புக்கும், அத்துடன் கணிக்கப்பட்ட பகுதிகளின் அளவிற்கும் இடையே ஒரு தொடர்பைக் காட்டியது. ஸ்டெரிக் சிப்பர்களை உருவாக்க.ஒரு தொடர்பு இருந்தது (துணை அட்டவணை 2 மற்றும் துணை படம் 9).
NT இழைகளை உருவாக்குவதற்கும், சாதகமான சூழ்நிலையில் ஜெல்களை உருவாக்குவதற்கும் NT இன் திறன், மற்ற புரதத் துண்டுகளுடன் NT இணைவுகள் இன்னும் இணைவு பங்காளிகளின் முழுச் செயல்பாடுகளுடன் ஜெல்களை உருவாக்க முடியும் என்று அனுமானிக்க வழிவகுத்தது.இதைச் சோதிக்க, பச்சை ஒளிரும் புரதம் (ஜிஎஃப்பி) மற்றும் பியூரின் நியூக்ளியோசைட் பாஸ்போரிலேஸ் (பிஎன்பி) ஆகியவற்றை முறையே என்டியின் சி-டெர்மினஸில் அறிமுகப்படுத்தினோம்.இதன் விளைவாக உருவான இணைவு புரதங்கள் E. coli இல் மிக அதிக இறுதி விளைச்சலுடன் வெளிப்படுத்தப்பட்டன (முறையே 150 mg/L மற்றும் 256 mg/L ஷேக் பிளாஸ்க் கலாச்சாரங்கள் அவரது-NT-GFP மற்றும் His-NT-PNP), காட்டப்பட்டுள்ளவற்றுடன் ஒத்துப்போகின்றன. NT Ref உடன் இணைந்த பிற புரதங்களுக்கு.30. His-NT-GFP (300mg/mL) மற்றும் His-NT-PNP (100mg/mL) இணைவு புரதங்கள் 2 மணி நேரம் மற்றும் 6.5 மணி நேரம் கழித்து 37°C இல் ஜெல்களை உருவாக்கியது, முக்கியமாக, GFP பின்னம் மாறாமல் இருந்தது.ஜெலேஷன் பிறகு கவனிக்கப்பட்டது, > 70% ஆரம்ப ஃப்ளோரசன்ஸ் தீவிரம் ஜெலேஷன் பிறகு மீதமுள்ளது (படம். 6a).அவரது-NT-PNP தீர்வுகள் மற்றும் ஜெல்களில் PNP செயல்பாட்டை அளவிட, நாம் NT உடன் இணைவு புரதத்தை நீர்த்துப்போகச் செய்ய வேண்டியிருந்தது, ஏனெனில் தூய தயாரிப்பின் நொதி செயல்பாடு ஜெல்லிங் செறிவுகளில் மதிப்பீட்டின் கண்டறிதல் வரம்பிற்கு வெளியே இருந்தது.0.01 mg/mL His-NT-PNP மற்றும் 100 mg/mL NT ஆகியவற்றைக் கொண்ட கலவையுடன் உருவாக்கப்பட்ட ஜெல், முன்கூட்டிய மாதிரிகளின் ஆரம்ப நொதி செயல்பாட்டில் 65% தக்கவைத்துக் கொண்டது (படம். 6b).அளவீட்டின் போது ஜெல் அப்படியே இருந்தது (துணை படம் 10).
ஹிஸ்-என்.டி-ஜி.எஃப்.பி (300 மி.கி./எம்.எல்) மற்றும் ஹிஸ்-என்.டி-ஜி.எஃப்.பி ஹைட்ரோஜெல் (300 மி.கி./எம்.எல்) கொண்ட தலைகீழ் குப்பியின் ஜெலேஷன் முன்பும் பின்பும் ஒரு ரிலேடிவ் ஃப்ளோரசன்ஸ் தீவிரம்.புள்ளிகள் தனிப்பட்ட அளவீடுகளைக் காட்டுகின்றன (n = 3), பிழை பார்கள் நிலையான விலகலைக் காட்டுகின்றன.சராசரி மதிப்பு பிழை பட்டிகளின் மையத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.b PNP செயல்பாடு NT (100 mg/ml) மற்றும் 0.01 mg/ml his-NT-PNP மற்றும் 100 mg/ml நியூ தைவான் டாலர்கள் கொண்ட கலவையைக் கொண்ட தீர்வுகள் மற்றும் ஜெல்களைப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோரோமெட்ரிக் பகுப்பாய்வு மூலம் பெறப்பட்டது.ஹிஸ்-என்டி-பிஎன்பி (5 மிமீ அளவுகோல்) கொண்ட ஹைட்ரஜலைக் கொண்ட தலைகீழ் குப்பியை இன்செட் காட்டுகிறது.
இங்கே, 37°C (படம் 1) இல் ஒரு புரதக் கரைசலை அடைகாப்பதன் மூலம் NT மற்றும் பிற மறுசீரமைப்பு ஸ்பைட்ரோயின் புரதங்களிலிருந்து ஹைட்ரஜல்கள் உருவாவதை நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம்.ஜெலேஷன் என்பது α-ஹெலிஸ்களை β-அடுக்குகளாக மாற்றுவது மற்றும் அமிலாய்டு போன்ற ஃபைப்ரில்களின் உருவாக்கம் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையது என்பதைக் காட்டுகிறோம் (படம். 3 மற்றும் 4).NT கள் சுருள் குளோபுலார் ஐந்து-ஹெலிக்ஸ் மூட்டைகளாக இருப்பதால், அவை மிக அதிக கரைதிறன் மற்றும் செறிவுகள் > 200 mg/mL 4°C இல் பல நாட்களுக்கு அதிக நிலைப்புத்தன்மை கொண்டவை.கூடுதலாக, µM இல் குறைந்த புரதச் செறிவுகளில் வெப்பக் குறைபாட்டிற்குப் பிறகு NT கள் உடனடியாக மீண்டும் மடிகின்றன.எங்கள் முடிவுகளின்படி, ஃபைப்ரில் உருவாவதற்கு>10 mg/mL புரதச் செறிவு மற்றும் சற்று உயர்ந்த வெப்பநிலை (படம் 1) ஆகியவற்றின் கலவை தேவைப்படுகிறது.உடலியல் நிலைமைகளின் கீழ் வெப்ப ஏற்ற இறக்கங்கள் காரணமாக பகுதியளவு விரிவடைந்த நிலையில் இருக்கும் குளோபுலார் மடிந்த புரதங்களிலிருந்து அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்கள் உருவாகலாம் என்ற கருத்துடன் இது ஒத்துப்போகிறது [48] .இந்த மாற்றத்திற்கு உட்படும் புரதங்களின் எடுத்துக்காட்டுகளில் இன்சுலின் 49,50, β2-மைக்ரோகுளோபுலின், டிரான்ஸ்தைரெடின் மற்றும் லைசோசைம்51,52,53 ஆகியவை அடங்கும்.NT அதன் சொந்த நிலையில் α-ஹெலிக்ஸ் என்றாலும், பாலிபெப்டைட் சங்கிலியின் தோராயமாக 65% ஸ்டெரிக் ஜிப்பர் உருவாக்கத்துடன் இணக்கமாக உள்ளது (படம் 4e) 45 .மோனோமர் மாறும் மொபைல் 46 என்பதால், இது மிதமான உயர்ந்த வெப்பநிலையில் இந்த சாத்தியமான அமிலாய்டோஜெனிக் பகுதிகளை வெளிப்படுத்த முடியும் மற்றும் மொத்த புரதத்தின் அதிக செறிவுகளில் அமிலாய்டு ஃபைப்ரில் உருவாக்கத்திற்கான முக்கியமான செறிவை அடையலாம்.இந்த காரணத்தைப் பின்பற்றி, ஸ்பைட்ரோயின் செறிவு மற்றும் ஜெலேஷன் நேரம் (படம் 1c) ஆகியவற்றுக்கு இடையே எதிர்மறையான தொடர்பைக் கண்டறிந்தோம், மேலும் மோனோமெரிக் NT இணக்கமானது பிறழ்வுகளால் (NT*, His-NT-L6) அல்லது உப்பு சேர்ப்பதன் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டால், தடுக்கலாம் உருவாக்கம் ஹைட்ரஜல்கள் (படம் 5).
பெரும்பாலான சந்தர்ப்பங்களில், அமிலாய்ட் ஃபைப்ரில்கள் கரைசலில் இருந்து ஒரு வீழ்படிவு போல மறைந்துவிடும், ஆனால் சில நிபந்தனைகளின் கீழ் அவை ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்கலாம்.ஹைட்ரோஜெல்-உருவாக்கும் ஃபைப்ரில்கள் பொதுவாக உயர் விகிதத்தைக் கொண்டுள்ளன மற்றும் மூலக்கூறு சிக்கலின் மூலம் நிலையான முப்பரிமாண நெட்வொர்க்குகளை உருவாக்குகின்றன, 55,58 எங்கள் முடிவுகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன.விட்ரோவில் ஹைட்ரஜல் உருவாவதற்கு, புரதங்கள் பெரும்பாலும் முழுமையாகவோ அல்லது பகுதியாகவோ விரிவடைகின்றன, எடுத்துக்காட்டாக, கரிம கரைப்பான்கள், அதிக வெப்பநிலை (70-90 ° C) மற்றும்/அல்லது குறைந்த pH (1.5-3.0)59,60,61,62 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு.இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஸ்பைட்ரோயின் ஹைட்ரோஜெல்களுக்கு கடுமையான செயலாக்கம் தேவையில்லை, அல்லது ஹைட்ரஜல்களை நிலைப்படுத்த குறுக்கு-இணைக்கும் முகவர்கள் தேவையில்லை.
பட்டு நூற்பு போது β-தாள் மாறுதலுக்கு உட்படும் ஸ்பைட்ரோயின் ரிபீட்ஸ் மற்றும் க்யூடிகள் ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்குகின்றன என்று முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டது.எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​அடைகாக்கும் நேரங்கள் மற்றும்/அல்லது அடைகாக்கும் வெப்பநிலை முறையே கணிசமாக நீண்டதாகவோ அல்லது அதிகமாகவோ இருந்தது, இதன் விளைவாக ஹைட்ரஜல்கள் பெரும்பாலும் ஒளிபுகாவாக இருந்தன (படம் 7 மற்றும் துணை அட்டவணை 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. வேகமான ஜெல் நேரங்களுக்கு கூடுதலாக, NT ஹைட்ரஜல்கள் >300 mg/mL (30%) மற்ற விவரிக்கப்பட்ட அனைத்து மறுசீரமைப்பு ஸ்பைடர் சில்க் புரத ஹைட்ரஜல்களையும், ஜெலட்டின், ஆல்ஜினேட் (2%), அகார் (0.5 %) போன்ற இயற்கை ஹைட்ரஜல்களையும் விஞ்சியது. ) மற்றும் கொலாஜன்.(0.6%) (படம் 7 மற்றும் துணை அட்டவணைகள் 1 மற்றும் 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
இந்த ஆய்வில் உள்ள ஹைட்ரோஜெல்களின் ஜெல் நேரம் மற்றும் மீள் மாடுலஸ் மற்ற ஸ்பைட்ரோயின் அடிப்படையிலான ஹைட்ரோஜெல்கள் மற்றும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இயற்கை ஹைட்ரோஜெல்களுடன் ஒப்பிடப்பட்டது.ஜெலேஷன் நிலைமைகளின் விளக்கத்துடன் குறிப்புகள் கொடுக்கப்பட்டுள்ளன.ஏபிஎஸ் அம்மோனியம் பெர்சல்பேட், அறை வெப்பநிலை.தரவு 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
சிலந்திகள் சேமிப்பின் போது ஸ்பைட்ரோயின் ஜெல்லிங்கைத் தடுக்கும் வழிகளை உருவாக்கியதாகத் தெரிகிறது.பட்டு சுரப்பியில் புரதத்தின் அதிக செறிவு இருந்தபோதிலும், முனைய டொமைனுடன் தொடர்புடைய பெரிய ரிபீட் பகுதியானது சுரப்பியில் உள்ள NT மற்றும் CT இன் வெளிப்படையான செறிவு இந்த ஆய்வின் எல்லையில் தோராயமாக 10-20 mg/ml க்கு ஒத்திருக்கிறது.இன் விட்ரோ கவனிக்கப்பட்ட ஹைட்ரஜல் உருவாக்கம் தேவை.கூடுதலாக, பட்டு சுரப்பிகளில் (படம் 5b) போன்ற உப்புகள் 16 NT ஐ நிலைப்படுத்தியது.NT கன்ஃபார்மேஷன் E. coli சைட்டோசோலில் ஆய்வு செய்யப்பட்டு, விட்ரோவில் பரிசோதிக்கப்பட்டதை விட இறுக்கமாக மடிந்திருப்பது கண்டறியப்பட்டது, மேலும் உப்பு அல்லது பிற காரணிகள் விவோவில் அதன் திரட்டலைத் தடுக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது.இருப்பினும், NT கள் β-ஷீட் ஃபைப்ரில்களாக மாற்றும் திறன் இழை உருவாக்கத்திற்கு முக்கியமானதாக இருக்கலாம் மற்றும் எதிர்கால ஆய்வுகளில் ஆராயப்பட வேண்டும்.
இந்த ஆய்வில் காணப்பட்ட NT-அமிலாய்டு போன்ற ஃபைப்ரில் மற்றும் ஹைட்ரஜல் உருவாக்கத்தின் புதிய அம்சங்களுடன் கூடுதலாக, இந்த நிகழ்வு உயிரி தொழில்நுட்பம் மற்றும் உயிரியல் மருத்துவ பயன்பாடுகளைக் கொண்டிருக்கலாம் என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம் (படம் 8).கருத்தின் சான்றாக, NT ஐ GFP அல்லது PNP உடன் இணைத்து, இணைவு புரதமும் 37 °C இல் அடைகாக்கும் போது ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்குகிறது என்பதையும், GFP மற்றும் PNP பின்னங்கள் பெரும்பாலும் அவற்றின் செயல்பாட்டைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன என்பதையும் காட்டினோம் (படம் 6).நியூக்ளியோசைட் பாஸ்போரிலேஸ்கள் நியூக்ளியோசைட் அனலாக்ஸின் முக்கியமான வினையூக்கிகள் தொகுப்பு ஆகும், இது உயிரி மருந்துத் தொழிலுக்கு எங்கள் கண்டுபிடிப்பை பொருத்தமானதாக ஆக்குகிறது.சாதகமான சூழ்நிலையில் வெளிப்படையான ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்கும் இணைவு புரதங்களை வெளிப்படுத்தும் கருத்து, நொதி அசையாமை, கட்டுப்படுத்தப்பட்ட மருந்து வெளியீடு மற்றும் திசு பொறியியல் போன்ற பரந்த அளவிலான பயன்பாடுகளுக்கு சாதகமான பண்புகளுடன் செயல்படும் ஹைட்ரோஜெல்களை உருவாக்க அனுமதிக்கிறது.கூடுதலாக, NT மற்றும் NT* ஆகியவை திறமையான வெளிப்பாடு குறிப்பான்கள்30 ஆகும், அதாவது NT மற்றும் அதன் மாறுபாடுகள் கரையக்கூடிய இணைவு புரதங்களின் உயர்-செயல்திறன் உற்பத்தி மற்றும் 3D ஹைட்ரஜல்களில் அசையாத இலக்கு புரதங்களை உருவாக்குவதற்கு பயன்படுத்தப்படலாம்.
NT கரையக்கூடியது, α-ஹெலிகல் மற்றும் குறைந்த செறிவுகள் (µM) மற்றும் 37°C இல் நிலையானது.அதே வெப்பநிலையில், ஆனால் அதிகரிக்கும் செறிவுகளில் (>10 mg/ml), NT அமிலாய்டு போன்ற ஃபைப்ரில்களைக் கொண்ட ஜெல்களை உருவாக்குகிறது.NT இணைவு புரதங்கள் முழு செயல்பாட்டு இணைவுத் துண்டுகளுடன் ஃபைப்ரில்லர் ஜெல்களையும் உருவாக்குகின்றன, இது NT ஐப் பயன்படுத்தி 3D ஹைட்ரோஜெல்களில் பல்வேறு புரதங்களை அசைக்க அனுமதிக்கிறது.கீழே: NT (PDB: 4FBS) மற்றும் ஃபைபர் நெட்வொர்க்குகள் மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய புரத கட்டமைப்புகளின் விளக்கப்படங்கள் (அளவிலானது மற்றும் வரையப்படவில்லை, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.224R0.221B).
கட்டுமானங்கள் (அமினோ அமில வரிசைகள் உட்பட முழுமையான பட்டியலுக்கு துணை அட்டவணை 4 ஐப் பார்க்கவும்) பிளாஸ்மிட் pT7 ஆக குளோன் செய்யப்பட்டு E. coli BL21 (DE3) ஆக மாற்றப்பட்டது.பொறிக்கப்பட்ட பிளாஸ்மிட்களைக் கொண்ட ஈ.கோலை லூரியா குழம்பில் கானாமைசின் (70 மி.கி./லி) உடன் கூடுதலாக செலுத்தப்பட்டு 30°C மற்றும் 250 rpm இல் ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டது.கலாச்சாரம் பின்னர் 1/100 கனாமைசின் கொண்ட LB ஊடகத்தில் செலுத்தப்பட்டது மற்றும் OD600 0.8 ஐ அடையும் வரை 30 ° C மற்றும் 110 rpm இல் வளர்க்கப்பட்டது.NMR ஆய்வுகளுக்கு, ஐசோடோப்புகளுடன் புரத லேபிளிங்கிற்காக 2 கிராம் D-குளுக்கோஸ் 13C (ஆல்ட்ரிச்) மற்றும் 1 கிராம் அம்மோனியம் குளோரைடு 15N (கேம்பிரிட்ஜ் ஐசோடோப் ஆய்வகங்கள், Inc.) கொண்ட M9 குறைந்தபட்ச ஊடகத்தில் பாக்டீரியா வளர்க்கப்பட்டது.வெப்பநிலையை 20 டிகிரி செல்சியஸாகக் குறைத்து, 0.15 mM ஐசோபிரைல்தியோகலாக்டோபிரானோசைடு (இறுதிச் செறிவு) உடன் புரத வெளிப்பாட்டைத் தூண்டவும்.ஒரே இரவில் புரத வெளிப்பாட்டிற்குப் பிறகு, செல்கள் 7278 × g, 4 ° C இல் 20 நிமிடங்களுக்கு அறுவடை செய்யப்பட்டன.செல் துகள்கள் 20 mM Tris-HCl, pH 8 இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, மேலும் பயன்படுத்தப்படும் வரை உறைந்தன.30 kPa இல் செல் டிஸ்ரப்டரை (TS தொடர் இயந்திரங்கள், கான்ஸ்டன்ட் சிஸ்டம்ஸ் லிமிடெட், இங்கிலாந்து) பயன்படுத்தி கரைக்கப்பட்ட செல்கள் லைஸ் செய்யப்பட்டன.பின்னர் லைசேட்டுகள் 25,000 கிராம் 30 நிமிடங்களுக்கு 4 ° C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன.NTMiSp க்கு, பெல்லட் 2 M யூரியா, 20 mM Tris-HCl, pH 8 இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, 2 நிமிடம் (2 வினாடிகள் ஆன்/ஆஃப், 65%) ஒலிக்கப்பட்டது, பின்னர் மீண்டும் 25,000 xg, 4° C. இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது. 30 நிமிடம்சூப்பர்நேட்டண்ட் ஒரு Ni-NTA நெடுவரிசையில் ஏற்றப்பட்டு, 20 mM Tris-HCl, 2 mM இமிடாசோல், pH 8 ஆகியவற்றால் கழுவப்பட்டு, இறுதியாக புரதமானது 20 mM Tris-HCl, 200 mM இமிடாசோல், pH 8 ஆகியவற்றைக் கொண்டு நீக்கப்பட்டது. NT2RepCT ஐ உருவாக்க மற்றும் NTCT, த்ரோம்பின் செரிமானம் அவரது மற்றும் NT இடையே தளத்தை (ThrCleav) அறிமுகப்படுத்துகிறது.த்ரோம்பின் பிளவு தளங்கள் His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ஐ உருவாக்குகிறது), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT ஐ உருவாக்குகிறது), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT ஐ உருவாக்குகிறது), His-Thioredoxin-ThrCleav-இலும் உள்ளன. .* (NT*ஐ உருவாக்குகிறது), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ஐ உருவாக்குகிறது), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ஐ உருவாக்குகிறது), மற்றும் His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSpdce (NTMiSpdce).கட்டுமானங்கள் த்ரோம்பின் (1:1000) மூலம் ஜீரணிக்கப்பட்டன மற்றும் 6-8 kDa மூலக்கூறு எடை வாசலைக் கொண்ட ஸ்பெக்ட்ரா/போர் டயாலிசிஸ் மென்படலத்தைப் பயன்படுத்தி 20 mM Tris-HCl, pH 8 உடன் 4° C இல் ஒரே இரவில் டயாலிஸ் செய்யப்பட்டன.டயாலிசிஸுக்குப் பிறகு, தீர்வு Ni-NTA நெடுவரிசையில் ஏற்றப்பட்டு, ஆர்வமுள்ள புரதத்தைக் கொண்ட கழிவுநீர் சேகரிக்கப்படுகிறது.உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறையின்படி பிராட்போர்டு மதிப்பீட்டைப் பயன்படுத்திய NTF1Sp தவிர, ஒவ்வொரு புரதத்தின் அழிவு குணகத்தைப் பயன்படுத்தி 280 nm இல் UV உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் புரத செறிவுகள் தீர்மானிக்கப்பட்டது.SDS பாலிஅக்ரிலாமைடு (4-20%) ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் Coomassie புத்திசாலித்தனமான நீல நிறக் கறை ஆகியவற்றால் தூய்மை தீர்மானிக்கப்பட்டது.20 நிமிட சுழற்சிகளில் 10 kDa மூலக்கூறு எடை கட்ஆஃப் உடன் 4000 xg இல் மையவிலக்கு வடிப்பான்களைப் (VivaSpin 20, GE ஹெல்த்கேர்) பயன்படுத்தி புரதங்கள் செறிவூட்டப்பட்டன.
புரதக் கரைசலைக் கரைத்து, 150 µl ஐ 1 மில்லி தெளிவான செப்டம் குப்பியில் (8 x 40 மிமீ தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) கவனமாகப் பிடுங்கவும்.குழாய்கள் ஆவியாவதைத் தடுக்க பாராஃபில்ம் மூலம் மூடி மூடப்பட்டன.மாதிரிகள் (n = 3) 37 டிகிரி செல்சியஸ் அல்லது 60 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டு, ஜெலேஷன் இருப்பதைக் கவனிக்க அவ்வப்போது தலைகீழாக மாற்றப்பட்டன.ஜெல் இல்லாத மாதிரிகள் குறைந்தது ஒரு வாரமாவது அடைகாக்கப்பட்டன.10 μM புரதத்திற்கு 10 mM DTT உடன் NTMiSp டைசல்பைட் பிணைப்புகளைக் குறைக்கவும்.இயற்கையான சிலந்தி பட்டு பூச்சுகளின் ஜெலேஷன்களை பகுப்பாய்வு செய்ய, ஸ்வீடிஷ் பிரிட்ஜ் ஸ்பைடர் வெட்டப்பட்டது, இரண்டு முக்கிய ஆம்புல்லட் சுரப்பிகள் 20 mM Tris-HCl இடையக pH 8 இல் 200 μl இல் வைக்கப்பட்டு, பூச்சு சுரப்பிகளில் இருந்து பிரிக்க அனுமதிக்க வெட்டப்பட்டது..சுரப்பிகளின் உள்ளடக்கங்கள் இடையகத்திலும், உலர் எடையை நிர்ணயிப்பதற்கு 50 µl (திறந்த குப்பிகளை 60 °C க்கு நிலையான எடைக்கு அடைகாப்பதன் மூலம்) மற்றும் 150 µl 37 °C இல் ஜெலேஷன் செய்யப்படுகின்றன.
அளவிடும் வடிவியல்/கருவியானது துருப்பிடிக்காத எஃகு மூலம் 20 மிமீ மேல் விட்டம் மற்றும் 0.5 மிமீ இடைவெளியுடன் இணையான தகடு மூலம் செய்யப்படுகிறது.துருப்பிடிக்காத எஃகு கீழே உள்ள பெல்டியர் பிளேட்டைப் பயன்படுத்தி ஒரு நிமிடத்திற்கு 1 °C என்ற விகிதத்தில் மாதிரியை 25 °C முதல் 45 °C வரையிலும், மீண்டும் 25 °C வரையிலும் சூடாக்கவும்.அதிர்வு அளவீடுகள் முறையே 100 mg/mL மற்றும் 300-500 mg/mL மாதிரிகளுக்கு 0.1 ஹெர்ட்ஸ் அதிர்வெண்ணிலும், பொருளின் நேரியல் விஸ்கோலாஸ்டிக் பகுதியில் 5% மற்றும் 0.5% விகாரத்திலும் மேற்கொள்ளப்பட்டன.ஆவியாவதைத் தடுக்க தனிப்பயன் ஈரப்பதம் அறையைப் பயன்படுத்தவும்.ப்ரிசம் 9 ஐப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
800 முதல் 3900 செ.மீ.–1 வரையிலான அறை வெப்பநிலையில் அகச்சிவப்பு (IR) நிறமாலையை சேகரிக்க.ATR சாதனம், மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் வழியாக ஒளி பாதை, சோதனைக்கு முன்னும் பின்னும் உலர் வடிகட்டிய காற்றால் சுத்தப்படுத்தப்படுகிறது.தீர்வுகள் (500 மி.கி./மி.லி. ஸ்பெக்ட்ராவில் நீர் உறிஞ்சுதல் உச்சத்தை குறைக்க) படிகங்களின் மீது குழாய் மூலம் செலுத்தப்பட்டது, மேலும் ஜெல் (500 மி.கி./மி.லி) அளவீட்டுக்கு முன் உருவாக்கப்பட்டு பின்னர் படிகங்களுக்கு மாற்றப்பட்டது (n = 3).1000 ஸ்கேன்கள் 2 செமீ-1 மற்றும் பூஜ்ஜிய கடமை சுழற்சி 2 என்ற தீர்மானத்துடன் பதிவு செய்யப்பட்டன. இரண்டாவது வழித்தோன்றல் ஒன்பது புள்ளிகளின் மென்மையான வரம்பைப் பயன்படுத்தி OPUS (Bruker) ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.1720 மற்றும் 1580 செ.மீ.-1 க்கு இடையில் ஸ்பெக்ட்ரா அதே ஒருங்கிணைப்பு பகுதிக்கு F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" ஐப் பயன்படுத்தி இயல்பாக்கப்பட்டது.ஏடிஆர்-ஐஆர் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபியில், அகச்சிவப்பு கற்றை மாதிரியில் ஊடுருவும் ஆழம் அலை எண் சார்ந்தது, இதன் விளைவாக அதிக அலை எண்களை விட குறைந்த அலை எண்களில் வலுவான உறிஞ்சுதல் ஏற்படுகிறது.படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ள நிறமாலைக்கு இந்த விளைவுகள் சரி செய்யப்படவில்லை.3 ஏனெனில் அவை மிகச் சிறியவை (துணை படம் 4).ப்ரூக்கர் OPUS மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி இந்த எண்ணிக்கைக்கான சரி செய்யப்பட்ட நிறமாலை கணக்கிடப்பட்டது.
கொள்கையளவில், அமைடு I உச்சத்தில் உள்ள கூறுகளின் நம்பகமான சிதைவுக்குப் பிறகு புரத இணக்கங்களின் விரிவான அளவீடு சாத்தியமாகும்.இருப்பினும், நடைமுறையில் சில தடைகள் உள்ளன.ஸ்பெக்ட்ரமில் சத்தம் டிகான்வல்யூஷனின் போது (தவறான) உச்சமாகத் தோன்றும்.கூடுதலாக, நீர் வளைவு காரணமாக ஏற்படும் உச்சநிலை அமைடு I சிகரத்தின் நிலையுடன் ஒத்துப்போகிறது மற்றும் இங்கு ஆய்வு செய்யப்பட்ட அக்வஸ் ஜெல் போன்ற அதிக அளவு நீரைக் கொண்ட மாதிரிகளுக்கு இதே அளவு இருக்கலாம்.எனவே, நாங்கள் அமைடு I உச்சத்தை முழுமையாக சிதைக்க முயற்சிக்கவில்லை, மேலும் எங்கள் அவதானிப்புகள் என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி போன்ற பிற முறைகளுக்கு ஆதரவாக மட்டுமே கருதப்பட வேண்டும்.
50 mg/ml NT மற்றும் His-NT2RepCT ஆகியவற்றின் தீர்வுகள் ஒரே இரவில் 37°C இல் ஜெல் செய்யப்பட்டன.ஹைட்ரோஜெல் பின்னர் 20 mM Tris-HCl (pH 8) உடன் 12.5 mg/ml செறிவுக்கு நீர்த்தப்பட்டு, நன்றாக குலுக்கி, ஜெல்லை உடைக்க பைப்பெட் செய்யப்பட்டது.அடுத்து, ஹைட்ரஜல் 20 mM Tris-HCl (pH 8) உடன் 10 முறை நீர்த்தப்பட்டது, 5 μl மாதிரியானது ஃபார்ம்வார் பூசப்பட்ட செப்பு கட்டத்திற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது, மேலும் அதிகப்படியான மாதிரி பிளாட்டிங் பேப்பரால் அகற்றப்பட்டது.மாதிரிகள் 5 µl மில்லிக்யூ தண்ணீரில் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு 5 நிமிடங்களுக்கு 1% யுரேனைல் ஃபார்மேட்டுடன் கறை படிந்தன.உறிஞ்சக்கூடிய காகிதத்துடன் அதிகப்படியான கறையை அகற்றவும், பின்னர் கண்ணி காற்றில் உலர்த்தவும்.100 kV இல் இயங்கும் FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ஐப் பயன்படுத்தி இந்த கட்டங்களில் இமேஜிங் செய்யப்பட்டது.படங்கள் x 26,500 மற்றும் x 43,000 உருப்பெருக்கங்களில் Veleta 2k × 2k CCD கேமராவைப் பயன்படுத்தி பதிவு செய்யப்பட்டன (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் (n = 1), 10–15 படங்கள் பதிவு செய்யப்பட்டன.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) பட பகுப்பாய்வு மற்றும் ஃபைபர் விட்டம் (n = 100, வெவ்வேறு இழைகள்) அளவிட பயன்படுத்தப்பட்டது.ப்ரிசம் 9 இணைக்கப்படாத டி-டெஸ்ட்களை (இரண்டு-வால்) செய்ய பயன்படுத்தப்பட்டது.சராசரி His-NT2RepCT மற்றும் NT ஃபைப்ரில்கள் முறையே 11.43 (SD 2.035) மற்றும் 7.67 (SD 1.389) nm ஆகும்.நம்பிக்கை இடைவெளி (95%) -4.246 முதல் -3.275 வரை.சுதந்திரத்தின் அளவுகள் = 198, ப <0.0001.
10 µM தியோஃப்ளேவின் T (ThT) கொண்ட 80 µl திரவ மாதிரிகள் கார்னிங் 96-வெல் பிளாக் பாட்டம் தெளிவான அடிமட்ட தகடுகளைப் பயன்படுத்தி மும்மடங்காக (n = 3) அளவிடப்பட்டன (கார்னிங் கிளாஸ் 3881, அமெரிக்கா).440 nm தூண்டுதல் வடிகட்டி மற்றும் 480 nm உமிழ்வு வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி ஃப்ளோரசன்ஸ் வேறுபாடுகள் பதிவு செய்யப்பட்டன (BMG Labtech, Offenburg, ஜெர்மனியில் இருந்து FLUOStar Galaxy).ThT சமிக்ஞை நிறைவுற்றதாகவோ அல்லது தணிக்கப்படவோ இல்லை, ஏனெனில் சிக்னல் தீவிரத்தை மாற்றாமல் ThT இன் வெவ்வேறு செறிவுகளுடன் சோதனைகள் செய்யப்பட்டன.மூடுபனி அளவீட்டிற்கு 360 nm இல் பதிவு உறிஞ்சுதல்.விதைப்பு பரிசோதனைக்காக, 100 mg/mL ஜெல் 37° C. இல் உருவாக்கப்பட்டு, மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு, 5%, 10% மற்றும் 20% என்ற மோலார் விகிதத்தில் விதைப்பதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டது.ப்ரிசம் 9 ஐப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
His-NT2RepCT மற்றும் NT>100 mg/mL ஆகியவற்றின் பங்குகளை பனியில் கரைத்து 0.22 µm வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டவும்.நானோட்ராப் பயன்படுத்தி 280 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் செறிவுகள் கணக்கிடப்பட்டன.தெளிவான அடிப்பகுதியுடன் 96-கிணறு கருப்பு பிணைக்காத தட்டு (கார்னிங்) கிணறுகளில், மாதிரிகள் 20 mM Tris-HCl pH 8 இல் 20 mg/mlக்கு நீர்த்தப்பட்டு 5 μM ThT (இறுதி செறிவு), மொத்த மாதிரி செறிவு 50 μl அளவு.செல்ஆப்சர்வர் (ஜீஸ்) நுண்ணோக்கியில் 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒவ்வொரு 10 நிமிடங்களுக்கும் மாதிரிகள் கடத்தப்பட்ட ஒளி சேனல் மற்றும் எஃப்ஐடிசி தூண்டுதல் மற்றும் ThT இமேஜிங்கிற்கான உமிழ்வு வடிகட்டி தொகுப்புகளுடன் படம் பிடிக்கப்பட்டன.இமேஜிங்கிற்கு 20x/0.4 லென்ஸ் பயன்படுத்தப்படுகிறது.ஜென் ப்ளூ (Zeiss) மற்றும் ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ஆகியவை பட பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன.20 mM Tris pH 8 மற்றும் 5 µM ThT ஆகியவற்றைக் கொண்ட 50 mg/mL செறிவில் NT மற்றும் His-NT2RepCT கரைசல்களிலிருந்தும் ஜெல் தயாரிக்கப்பட்டு 90 நிமிடங்களுக்கு 37°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது.ஜெல் துண்டுகள் 20 mM Tris, pH 8, மற்றும் 5 μM ThT ஆகியவற்றைக் கொண்ட புதிய கிணற்றுக்கு பிணைக்கப்படாத கருப்பு 96 நன்கு தெளிவான கீழ்த் தட்டில் மாற்றப்பட்டன.20x/0.4 உருப்பெருக்கத்தில் பச்சை ஒளிரும் மற்றும் பிரகாசமான புலப் படங்களைப் பெறவும்.பட பகுப்பாய்விற்கு ImageJ பயன்படுத்தப்பட்டது.
தீர்வு NMR ஸ்பெக்ட்ரா 310 K இல் 600 MHz Bruker Avance Neo ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) பொருத்தப்பட்டது.20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) இல் 13C, 15N என பெயரிடப்பட்ட 10 mg/mL ஒரே மாதிரியான புரதத்தைக் கொண்ட NMR மாதிரிகள் .15N-HSQC இன் 2D ஸ்பெக்ட்ரமில் உச்சம் 23 ஐ ஒதுக்க pH 6.7 இல் NT2RepCT இன் வேதியியல் மாற்றங்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன.
மேஜிக் ஆங்கிள் ஸ்பின்னிங் திட NMR (MAS) ஸ்பெக்ட்ரா 13C, 15N-லேபிளிடப்பட்ட ஹைட்ரஜல்கள் ப்ரூக்கர் அவான்ஸ் III HD ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் 800 MHz இல் 3.2 மிமீ 13C/15N{1H} எலக்ட்ரான்லெஸ் ப்ரோப் பொருத்தப்பட்டது.மாதிரி வெப்பநிலையானது 277 K இல் மாறி வெப்பநிலை வாயு ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்தி கட்டுப்படுத்தப்பட்டது. இரு பரிமாண இருமுனை சுழற்சி அதிர்வு (DARR)76 மற்றும் ரேடியோ அலைவரிசை மறு இணைப்பு (RFDR)77 ஸ்பெக்ட்ரா ஆகியவை முறையே 12.5 kHz மற்றும் 20 kHz MAS அதிர்வெண்களில் பெறப்பட்டன.1H முதல் 13C வரையிலான குறுக்கு துருவமுனைப்பு (CP) 1H இல் 60.0 முதல் 48.0 kHz வரையிலான நேரியல் வளைவைப் பயன்படுத்தி, 13C இல் 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS இல்) மற்றும் தொடர்பு நேரம் 0.5–1 ms.73.5 kHz இல் Spinal6478 துண்டித்தல் தரவு சேகரிப்பின் போது பயன்படுத்தப்பட்டது.கையகப்படுத்தல் நேரம் 10 மில்லி விநாடிகள் மற்றும் சுழற்சி தாமதம் 2.5 வினாடிகள்.RFDR நிறமாலையில் காணப்பட்ட ஒற்றை-இணைக்கப்பட்ட Cα/Cβ தொடர்புகள், DARR நிறமாலையில் உள்ள சிறப்பியல்பு எச்ச வகை இரசாயன மாற்றங்கள் மற்றும் பெருக்கி-இணைக்கப்பட்ட தொடர்புகளின் அடிப்படையில் ஒதுக்கப்பட்டன.
Zipper79 தரவுத்தளமானது (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp மற்றும் NTMiSp க்கான படபடப்பு போக்குகள் மற்றும் ரொசெட்டா ஆற்றலை மதிப்பீடு செய்ய பயன்படுத்தப்பட்டது.ஜிப்பர் தரவுத்தளமானது ரொசெட்டா எனர்ஜி80ஐ கணக்கிடுகிறது, இது புரத கட்டமைப்பை மாதிரி மற்றும் பகுப்பாய்வு செய்ய பல இலவச ஆற்றல் செயல்பாடுகளை ஒருங்கிணைக்கிறது.ஆற்றல் நிலை -23 கிலோகலோரி/மோல் அல்லது அதற்கும் குறைவானது, ஃபைப்ரிலேட் செய்வதற்கான அதிகப் போக்கைக் குறிக்கிறது.குறைந்த ஆற்றல் என்பது ரிவிட் அமைப்பில் உள்ள இரண்டு β-இழைகளின் அதிக நிலைத்தன்மையைக் குறிக்கிறது.கூடுதலாக, NT, NTFlSp மற்றும் NTMiSp Ref இல் அமிலாய்டோஜெனிக் பகுதிகளைக் கணிக்க வால்ட்ஸ் அல்காரிதம் பயன்படுத்தப்பட்டது.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT புரதக் கரைசல் pH ஐ pH 6 மற்றும் 7 ஆகக் குறைக்க pH 5.5 மற்றும் 6.0 இல் 2-(N-morpholino) எத்தனெசல்ஃபோனிக் அமிலம் (MES) இடையகத்துடன் கலக்கப்பட்டது.இறுதி புரதச் செறிவு 100 மி.கி/மி.லி.
J-1500 CD ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (JASCO, USA) 0.1 செமீ ஆப்டிகல் பாதையுடன் 300 μL குவெட்டைப் பயன்படுத்தி அளவீடுகள் செய்யப்பட்டன.20 mM பாஸ்பேட் பஃப்பரில் (pH 8) புரதங்கள் 10 μM (n = 1) க்கு நீர்த்தப்பட்டன.உப்பு முன்னிலையில் புரத நிலைத்தன்மையை பகுப்பாய்வு செய்ய, புரதங்கள் முறையே 154 mM NaF அல்லது NaCl கொண்ட 20 mM பாஸ்பேட் பஃப்பரில் (pH 8) அதே செறிவில் (n = 1) பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.வெப்பநிலை ஸ்கேன்கள் 25 ° C முதல் 95 ° C வரை 222 nm இல் 1 ° C/min வெப்ப விகிதத்துடன் பதிவு செய்யப்பட்டன.பூர்வீகமாக மடிக்கப்பட்ட புரதங்களின் விகிதம் (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது.கூடுதலாக, ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் ஐந்து ஸ்பெக்ட்ரா 260 nm முதல் 190 nm வரை 25 ° C மற்றும் 95 ° C க்கு வெப்பப்படுத்தப்பட்ட பிறகு பதிவு செய்யப்பட்டது.ஐந்து நிறமாலைகள் சராசரியாக, மென்மையாக்கப்பட்டு மோலார் நீள்வட்டமாக மாற்றப்பட்டன.ப்ரிசம் 9 ஐப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) இன் ஃப்ளோரசன்ஸின் தீவிரம், நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் கருப்பு வெளிப்படையான அடிப்பகுதியுடன் (கார்னிங் கிளாஸ் 3881, USA) 96-கிணறு கார்னிங் தட்டுகளில் மும்மடங்காக (n = 3) அளவிடப்பட்டது.395 nm தூண்டுதல் அலைநீளத்துடன் கூடிய ஃப்ளோரசன்ஸ் அடிப்படையிலான பிளேட் ரீடரைக் கொண்டு மாதிரிகளை அளவிடவும் மற்றும் உமிழ்வை 509 nm க்கு முன் ஜெலேஷன் மற்றும் 2 மணி நேரம் கழித்து 37 ° C இல் பதிவு செய்யவும்.ப்ரிசம் 9 மூலம் தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
ப்யூரின் நியூக்ளியோசைட் பாஸ்போரிலேஸ் செயல்பாட்டு மதிப்பீட்டு கிட் (ஃப்ளோரோமெட்ரிக் முறை, சிக்மா ஆல்ட்ரிச்) உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி பயன்படுத்தப்பட்டது.ஜெல் மற்றும் ஹிஸ்-என்டி-பிஎன்பி கொண்ட கரைசல்களில் செயல்பாட்டை அளவிட, 10 என்ஜி ஹிஸ்-என்டி-பிஎன்பியை 100 மி.கி/எம்.எல் என்.டியுடன் 2 µL மொத்த அளவாகக் கலக்கவும், ஏனெனில் ஜெல் தொகுப்பின் கண்டறிதல் இடைவெளிக்கு மேலே ஒரு சிக்னலைக் கொடுத்தது.அவரது-NT-PNP இல்லாத ஜெல் மற்றும் தீர்வுகளுக்கான கட்டுப்பாடுகள் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன.அளவீடுகள் இரண்டு முறை மேற்கொள்ளப்பட்டன (n = 2).செயல்பாடு அளவிடப்பட்ட பிறகு, எதிர்வினை கலவை அகற்றப்பட்டு, அளவீட்டின் போது ஜெல் அப்படியே இருப்பதை உறுதிசெய்ய ஜெல் புகைப்படம் எடுக்கப்பட்டது.ப்ரிசம் 9 ஐப் பயன்படுத்தி தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
ஆய்வு வடிவமைப்பு பற்றிய கூடுதல் தகவலுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள இயற்கை ஆய்வு சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
புள்ளிவிவரங்கள் 1 மற்றும் 2 ஆரம்ப தரவை வழங்குகின்றன.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, மற்றும் 6, துணைப் படம்.3, துணை அத்தி.5a, d, துணை அத்தி.6 மற்றும் துணை அத்தி.8. இந்த ஆய்வின் தரவுத் தரவு Zenodo தரவுத்தளத்தில் ஹோஸ்ட் செய்யப்பட்டுள்ளது https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.இந்த ஆய்வில் பெறப்பட்ட NMR தரவு, bmrbig36 என்ட்ரி ஐடியின் கீழ் BMRBig களஞ்சியத்தில் இடுகையிடப்பட்டது.GFP மற்றும் PNP இன் கட்டமைப்புகள் PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) இலிருந்து எடுக்கப்பட்டது.
ரைசிங், ஏ. மற்றும் ஜோஹன்சன், ஜே. ஸ்பின்னிங் செயற்கை சிலந்தி பட்டு.தேசிய இரசாயனம்.உயிரியல்.11, 309–315 (2015).
பாப், பிஎல் மற்றும் பலர்.Nephila clavipes மரபணு சிலந்தி பட்டு மரபணுக்களின் பன்முகத்தன்மையையும் அவற்றின் சிக்கலான வெளிப்பாட்டையும் எடுத்துக்காட்டுகிறது.தேசிய ஜெனட்.49, 895–903 (2017).