347 12.7*1.24 மிமீ துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய்கள், ஒத்திசைவான மின்னியல் ஒடுக்கம் மற்றும் α-சினுக்ளின் மற்றும் டவு ஆகியவற்றின் ஒருங்கிணைப்பின் மூலக்கூறு வழிமுறை

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரு ஸ்லைடிற்கு மூன்று கட்டுரைகளைக் காட்டும் ஸ்லைடர்கள்.ஸ்லைடுகளின் வழியாக செல்ல பின் மற்றும் அடுத்த பட்டன்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒவ்வொரு ஸ்லைடையும் நகர்த்த இறுதியில் ஸ்லைடு கன்ட்ரோலர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.

347 துருப்பிடிக்காத எஃகு குழாய் விவரக்குறிப்பு

347 12.7*1.24மிமீ துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய்கள்

வெளிப்புற விட்டம்: 6.00 மிமீ OD முதல் 914.4 மிமீ OD வரை, அளவுகள் 24” NB வரை கிடைக்கும் எக்ஸ்-ஸ்டாக், OD அளவு ஸ்டீல் குழாய்கள் எக்ஸ்-ஸ்டாக் கிடைக்கும்

SS 347 குழாய் தடிமன் வரம்பு: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, முதலியன (0.5-12 மிமீ) அல்லது தேவைக்கேற்ப வழக்கமான அளவு அல்லாத அளவு

வகை: SS 347 தடையற்ற குழாய்கள் |SS 347 ERW பைப்புகள் |SS 347 வெல்டட் பைப்புகள் |SS 347 ஃபேப்ரிகேட்டட் பைப்புகள் |SS 347 CDW குழாய்கள், LSAW பைப்புகள் / சீம்-வெல்டட் / மீண்டும் வரையப்பட்டது

படிவம்: SS 347 வட்ட குழாய்கள்/ குழாய்கள், SS 347 சதுர குழாய்கள்/ குழாய்கள், SS 347 செவ்வக குழாய்/ குழாய்கள், SS 347 சுருள் குழாய்கள், SS 347 "U" வடிவம், SS 347 பான் கேக் சுருள்கள், Hydraulic 347

நீளம்: சிங்கிள் ரேண்டம், டபுள் ரேண்டம் & தேவையான நீள முடிவு: ப்ளைன் எண்ட், பெவல்டு எண்ட், ட்ரெட்டு

இறுதிப் பாதுகாப்பு: பிளாஸ்டிக் தொப்பிகள் |வெளிப்புற பூச்சு: 2B, எண்.4, எண்.1, எண்.8 துருப்பிடிக்காத ஸ்டீல் குழாய்களுக்கான மிரர் பினிஷ், வாடிக்கையாளர் தேவைகளின்படி முடிக்கவும்

விநியோக நிலை: அனீல்ட் மற்றும் ஊறுகாய், பாலிஷ், பிரைட் அனீல்ட், குளிர் வரையப்பட்டது

ஆய்வு, சோதனை அறிக்கைகள்: மில் சோதனைச் சான்றிதழ்கள், EN 10204 3.1, இரசாயன அறிக்கைகள், இயந்திரவியல் அறிக்கைகள், PMI சோதனை அறிக்கைகள், காட்சி ஆய்வு அறிக்கைகள், மூன்றாம் தரப்பு ஆய்வு அறிக்கைகள், NABL அங்கீகரிக்கப்பட்ட ஆய்வக அறிக்கைகள், அழிவுகரமான சோதனை அறிக்கை, அழிவுகரமான சோதனை அறிக்கைகள்

பேக்கிங்: மரப்பெட்டிகள், பிளாஸ்டிக் பைகள், ஸ்டீல் கீற்றுகள் தொகுக்கப்பட்டவை அல்லது வாடிக்கையாளர்களின் வேண்டுகோளின்படி

சிறப்புகள்: மேலே தவிர மற்ற அளவுகள் மற்றும் விவரக்குறிப்புகள் கோரிக்கையின் பேரில் தயாரிக்கப்படலாம்

SS 347 பைப் அளவு வரம்பு: 1/2 இன்ச் NB, OD முதல் 24 அங்குலம் வரை

ASTM A312 347: அதிக வெப்பநிலை மற்றும் பொது அரிக்கும் சேவைக்காக வடிவமைக்கப்பட்ட தடையற்ற மற்றும் நேராக-சீம் வெல்டட் ஆஸ்டெனிடிக் குழாய்.வெல்டிங் போது உலோக நிரப்பு அனுமதிக்கப்படவில்லை.

ASTM A358 347: அரிக்கும் மற்றும்/அல்லது அதிக வெப்பநிலை சேவைக்கான மின்சார இணைவு வெல்டட் ஆஸ்டெனிடிக் குழாய்.பொதுவாக 8 இன்ச் வரையிலான குழாய் மட்டுமே இந்த விவரக்குறிப்பில் தயாரிக்கப்படுகிறது.வெல்டிங் போது நிரப்பு உலோகம் சேர்க்க அனுமதிக்கப்படுகிறது.

ASTM A790 347: தடையற்ற மற்றும் நேராக-சீம் வெல்டட் ஃபெரிடிக்/ஆஸ்டெனிடிக் (டூப்ளக்ஸ்) குழாய், பொதுவான அரிக்கும் சேவையை நோக்கமாகக் கொண்டது, அழுத்த அரிப்பு விரிசலுக்கு எதிர்ப்புத் தெரிவிக்கிறது.

ASTM A409 347: ஸ்ட்ரைட்-சீம் அல்லது ஸ்பைரல்-சீம் எலக்ட்ரிக் ஃப்யூஷன் வெல்டிங் செய்யப்பட்ட பெரிய விட்டம் கொண்ட ஆஸ்டெனிடிக் லைட்-வால் பைப் 14” முதல் 30” வரை சுவர்கள் Sch5S மற்றும் Sch 10S உடன் அரிக்கும் மற்றும்/அல்லது உயர்வானது

ASTM A376 347: அதிக வெப்பநிலை பயன்பாடுகளுக்கான தடையற்ற ஆஸ்டெனிடிக் குழாய்.

ASTM A813 347: அதிக வெப்பநிலை மற்றும் பொதுவான அரிக்கும் பயன்பாடுகளுக்கான ஒற்றை-சீம், ஒற்றை அல்லது இரட்டை-வெல்டட் ஆஸ்டெனிடிக் குழாய்.

ASTM A814 347: அதிக வெப்பநிலை மற்றும் பொது அரிக்கும் சேவைக்கான குளிர் வேலை வெல்டட் ஆஸ்டெனிடிக் குழாய்.

347H துருப்பிடிக்காத எஃகு குழாய்கள் இரசாயன கலவை

துருப்பிடிக்காத எஃகு 347H குழாய் இயந்திர பண்புகள்

துருப்பிடிக்காத எஃகு 347H குழாய்கள் உடல் பண்புகள்

347H துருப்பிடிக்காத எஃகு குழாய்க்கு சமமான தரங்கள்

அமிலாய்டு ஆல்பா-சினுக்ளின் (αS) திரட்டல் என்பது பார்கின்சன் நோய் மற்றும் பிற சினுக்ளினோபதிகளின் ஒரு அடையாளமாகும்.சமீபத்தில், அல்சைமர் நோயுடன் பொதுவாக தொடர்புடைய டவ் புரதம் αS நோயியலுடன் தொடர்புடையது மற்றும் αS- நிறைந்த சேர்ப்புகளில் இணை-உள்ளூர்மயமாக்கல் கண்டறியப்பட்டது, இருப்பினும் இரண்டு புரதங்களின் ஒருங்கிணைப்பின் மூலக்கூறு வழிமுறை தெளிவாக இல்லை.டாவ் போன்ற நேர்மறை சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பாலிபெப்டைடுகளுடன் மின்னியல் சிக்கலான ஒடுக்கம் வழியாக αS கட்டம் திரவ மின்தேக்கிகளாக பிரிக்கப்படுகிறது என்பதை நாங்கள் இங்கு தெரிவிக்கிறோம்.பாலிகேஷன்களுக்கான αS இன் தொடர்பு மற்றும் உறைதல் வலையமைப்பின் வேலன்ஸ் குறைவு விகிதத்தைப் பொறுத்து, உறைவுகள் விரைவான ஜெலேஷன் அல்லது ஒருங்கிணைப்புக்கு உட்படுகின்றன, அதைத் தொடர்ந்து மெதுவான அமிலாய்டு திரட்டல் ஏற்படுகிறது.மேம்பட்ட உயிர் இயற்பியல் நுட்பங்களின் தொகுப்பை இணைப்பதன் மூலம், திரவ-திரவ αS/Tau கட்டப் பிரிப்பை வகைப்படுத்த முடிந்தது மற்றும் ஒரு திரவ புரதக் குவிப்பில் இரு புரதங்களையும் கொண்ட பன்முகத் திரட்டுகளை உருவாக்குவதற்கு வழிவகுக்கும் முக்கிய காரணிகளை அடையாளம் காண முடிந்தது.
சவ்வுப் பெட்டிகளுடன் கூடுதலாக, உயிரணுக்களில் இடம்சார்ந்த பிரிப்பு, புரதம் நிறைந்த, திரவ-போன்ற அடர்த்தியான உடல்களை உருவாக்குவதன் மூலம் அடையலாம், இது உயிரியக்கக் குவிப்பு அல்லது நீர்த்துளிகள் எனப்படும், திரவ-திரவ கட்டப் பிரிப்பு (LLPS) எனப்படும்.இந்த நீர்த்துளிகள் பொதுவாக புரதங்கள் அல்லது புரோட்டீன்கள் மற்றும் ஆர்என்ஏ ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான பன்முகத் தற்காலிக இடைவினைகளால் உருவாகின்றன, மேலும் கிட்டத்தட்ட அனைத்து வாழ்க்கை அமைப்புகளிலும் பல்வேறு செயல்பாடுகளைச் செய்கின்றன.அதிக எண்ணிக்கையிலான LLP-திறன் கொண்ட புரதங்கள் குறைந்த சிக்கலான தன்மையை வெளிப்படுத்துகின்றன, அவை இயற்கையில் மிகவும் சீர்குலைந்துள்ளன மற்றும் உயிரியக்கக் குவிப்புகளின் உருவாக்கத்தில் 3,4,5.பல சோதனை ஆய்வுகள் இந்த திரவ-போன்ற மின்தேக்கிகளை உருவாக்கும் புரதங்களின் நெகிழ்வான, அடிக்கடி ஒழுங்கற்ற மற்றும் பன்முகத்தன்மையை வெளிப்படுத்தியுள்ளன, இருப்பினும் இந்த மின்தேக்கிகளின் வளர்ச்சி மற்றும் முதிர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்தும் குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு தீர்மானிப்பவர்கள் பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை. நிலை..
புதிய தரவு, மாறுபட்ட புரதத்தால் இயக்கப்படும் எல்எல்பிஎஸ் மற்றும் நீர்த்துளிகளை திடமான கட்டமைப்புகளாக மாற்றுவது தொடர்புடைய செல்லுலார் பாதைகளாக இருக்கலாம், அவை கரையாத நச்சுத் திரட்டுகளை உருவாக்குவதற்கு வழிவகுக்கும், அவை பெரும்பாலும் சிதைவு நோய்களின் அடையாளங்களாகும்.பல எல்.எல்.பி.எஸ்-தொடர்புடைய உள்ளார்ந்த ஒழுங்கற்ற புரதங்கள் (ஐடிபிகள்), பெரும்பாலும் அதிக சார்ஜ் மற்றும் நெகிழ்வானவை, அமிலாய்டு திரட்டல் செயல்முறையின் மூலம் நரம்பியக்கடத்தலுடன் நீண்ட காலமாக தொடர்புடையவை.குறிப்பாக, FUS7 அல்லது TDP-438 போன்ற உயிரி மூலக்கூறு IDP மின்தேக்கிகள் அல்லது hnRNPA19 போன்ற பெரிய குறைந்த சிக்கலான களங்களைக் கொண்ட புரதங்கள் திரவமயமாக்கல் எனப்படும் செயல்முறையின் மூலம் ஜெல் போன்ற அல்லது திடமான வடிவங்களில் வயதாகிவிட்டன.கலவை.திடமான கட்ட மாற்றத்திற்கு (LSPT) நேரத்தின் செயல்பாடாக அல்லது சில மொழிபெயர்ப்புக்கு பிந்தைய மாற்றங்கள் அல்லது நோயியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க பிறழ்வுகளுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக.
விவோவில் LLPS உடன் தொடர்புடைய மற்றொரு IDP ஆனது Tau ஆகும், இது ஒரு நுண்குழாய்-தொடர்புடைய ஒழுங்கற்ற புரதமாகும், அதன் அமிலாய்டு திரட்டல் அல்சைமர் நோய்க்கு உட்படுத்தப்பட்டுள்ளது10 ஆனால் சமீபத்தில் பார்கின்சன் நோய் (PD) மற்றும் பிற சினாப்டிக் அணு புரோட்டினோபதிகள் 11, 12, 13 தொடர்புடையவை.சாதகமான மின்னியல் இடைவினைகள் காரணமாக Tau கரைசல்/சைட்டோபிளாஸத்தில் இருந்து தன்னிச்சையாகப் பிரிந்துவிடுவதாகக் காட்டப்பட்டது.இயற்கையில் உள்ள பல உயிரி மூலக்கூறு மின்தேக்கிகளின் உந்து சக்தியாக இந்த வகையான குறிப்பிட்ட அல்லாத தொடர்பு உள்ளது என்பதும் கவனிக்கப்பட்டது.ஒரு டவ் புரதத்தைப் பொறுத்தவரை, எலக்ட்ரோஸ்டேடிக் திரட்டலை எளிய திரட்டல் மூலம் உருவாக்கலாம், இதில் புரதத்தின் எதிர் சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பகுதிகள் பிளவு செயல்முறையைத் தூண்டுகின்றன, அல்லது ஆர்என்ஏ போன்ற எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பாலிமர்களுடன் தொடர்பு மூலம் சிக்கலான திரட்டல் மூலம்.
சமீபத்தில், α-synuclein (αS), PD மற்றும் பிற நரம்பியக்கடத்தல் நோய்களில் உட்படுத்தப்பட்ட ஒரு அமிலாய்டு IDP ஆனது, synucleinopathy17,18 என அறியப்படுகிறது, இது செல்லுலார் மற்றும் விலங்கு மாதிரிகளில் 19,20 திரவம் போன்ற நடத்தை கொண்ட புரதக் கண்டன்சேட்டுகளில் செறிவூட்டப்பட்டது.முதன்மையாக ஹைட்ரோபோபிக் இடைவினைகள் மூலம் எளிய ஒருங்கிணைப்பு மூலம் αS LLPSக்கு உட்படுகிறது என்று விட்ரோ ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன, இருப்பினும் இந்த செயல்முறைக்கு விதிவிலக்காக அதிக புரதச் செறிவுகள் மற்றும் வித்தியாசமான நீண்ட அடைகாக்கும் நேரங்கள் தேவைப்படுகின்றன.விவோவில் காணப்பட்ட αS-கொண்ட மின்தேக்கிகள் இதனாலும் அல்லது பிற LLPS செயல்முறைகளாலும் உருவாக்கப்பட்டதா என்பது தீர்க்கப்படாத ஒரு முக்கிய பிரச்சினையாகவே உள்ளது.இதேபோல், PD மற்றும் பிற synucleinopathies இல் உள்ள நியூரான்களில் αS அமிலாய்டு திரட்டல் காணப்பட்டாலும், αS உள்செல்லுலார் அமிலாய்டு திரட்டலுக்கு உட்படும் சரியான வழிமுறை தெளிவாக இல்லை, ஏனெனில் இந்த புரதத்தின் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு தானாகவே இந்த செயல்முறையைத் தூண்டுவதாகத் தெரியவில்லை.கூடுதல் செல்லுலார் சேதம் அடிக்கடி தேவைப்படுகிறது, சில செல்லுலார் இடங்கள் அல்லது நுண்ணிய சூழல்கள் உள்செல்லுலார் αS அமிலாய்டு கூட்டங்களின் மறு அணுக்கருவுக்கு தேவை என்று பரிந்துரைக்கிறது.ஒரு செல்லுலார் சூழல், குறிப்பாக திரட்டுதலுக்கு ஆளாகிறது, இது புரதக் கண்டன்செட்டுகளின் உட்புறமாக இருக்கலாம் 23 .
சுவாரஸ்யமாக, பார்கின்சன் நோய் மற்றும் பிற synucleinopathies 24,25 உள்ள மனிதர்களின் சிறப்பியல்பு நோய் சேர்க்கைகளில் αS மற்றும் tau ஆகியவை இணை-உள்ளூர்மயமாக்கல் கண்டறியப்பட்டது மற்றும் சோதனைகள் இரண்டு புரதங்களுக்கு இடையே ஒரு ஒருங்கிணைந்த நோயியல் உறவைப் புகாரளித்துள்ளன 26,27 திரட்டுதல் αS மற்றும் இடையே சாத்தியமான உறவைக் குறிக்கிறது. நரம்பியக்கடத்தல் நோய்களில் tau.உடல் நலமின்மை.αS மற்றும் tau ஆகியவை விட்ரோ மற்றும் விவோ 28,29 இல் பரஸ்பர ஒருங்கிணைப்பை ஊக்குவித்தல் மற்றும் ஊக்குவித்தல் மற்றும் இந்த இரண்டு புரதங்களால் ஆன பன்முகத் தொகுப்புகள் synucleinopathies நோயாளிகளின் மூளையில் காணப்படுகின்றன 30 .இருப்பினும், αS மற்றும் tau இடையேயான தொடர்புகளின் மூலக்கூறு அடிப்படை மற்றும் அதன் இணை ஒருங்கிணைப்பின் வழிமுறை பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.αS இன் மிகவும் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட சி-டெர்மினல் பகுதிக்கும் மத்திய புரோலைன் நிறைந்த பகுதியான டவுவுக்கும் இடையே உள்ள மின்னியல் ஈர்ப்பு மூலம் tau உடன் தொடர்புகொள்வதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது, இது நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்களால் செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது.
இந்த ஆய்வில், பாலி-எல்-லைசின் (பிஎல்கே) போன்ற பிற நேர்மறை சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பாலிபெப்டைடுகளுடனான அதன் தொடர்புக்கு மாறாக, டாவ் புரதத்தின் முன்னிலையில் மின்னியல் சிக்கலான ஒடுக்கம் வழியாக αS உண்மையில் நீர்த்துளிகளாகப் பிரிக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறோம்.αS துளி நெட்வொர்க்கிற்கான சாரக்கட்டு மூலக்கூறாக செயல்படுகிறது.எலக்ட்ரோஸ்டேடிக் αS கோசர்வேட்டுகளின் முதிர்ச்சியின் செயல்பாட்டில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை நாங்கள் கண்டறிந்துள்ளோம், அவை கோசர்வேட் நெட்வொர்க்கில் ஈடுபட்டுள்ள புரதங்களின் தொடர்புகளின் வேலன்சி மற்றும் வலிமையில் உள்ள வேறுபாடுகளுடன் தொடர்புடையவை.சுவாரஸ்யமாக, αS மற்றும் tau அமிலாய்டு புரதங்களின் இணை-திரட்சியை நீண்ட கால திரவ உறைவுகளில் நாங்கள் கவனித்தோம், மேலும் அத்தகைய கோசர்வேட்டுகளில் இந்த இரண்டு புரதங்களின் இணை ஒருங்கிணைப்புக்கு வழிவகுக்கும் சில முக்கிய காரணிகளை அடையாளம் கண்டோம்.இந்த செயல்முறையை இங்கே விரிவாக விவரிக்கிறோம், இது நோய்-குறிப்பிட்ட சேர்த்தல்களில் இரண்டு புரதங்களின் கோலோகலைசேஷன் அடிப்படையிலான சாத்தியமான மூலக்கூறு பொறிமுறையாகும்.
αS ஆனது நடுநிலை pH (படம் 1a) இல் அதிக அயோனிக் சி-டெர்மினல் வால் உள்ளது, மேலும் பாலிகேஷனிக் சீர்குலைந்த பாலிபெப்டைட் மூலக்கூறுகளுடன் கூடிய மின்னியல் வளாகங்களின் ஒடுக்கம் மூலம் அது LLPS க்கு உட்படுத்தப்படலாம் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம்.நடுநிலை pH 32 இல் நேர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட மற்றும் ஒழுங்கற்ற பாலிமெரிக் இயல்பு காரணமாக 100-எச்சம் பாலி-L-லைசின் (pLK) தொடக்க மாதிரி மூலக்கூறாகப் பயன்படுத்தினோம். முதலில், தீர்வு NMR ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி மூலம் pLK αS இன் Ct டொமைனுடன் தொடர்பு கொள்கிறது என்பதை உறுதிப்படுத்தினோம். (படம் 1b) அதிகரிக்கும் αS:pLK மோலார் விகிதங்களின் முன்னிலையில் 13C/15N-லேபிளிடப்பட்ட αS ஐப் பயன்படுத்துகிறது.αS இன் Ct-டொமைனுடன் pLK இன் தொடர்பு இரசாயன மாற்றத்தின் இடையூறுகள் மற்றும் புரதத்தின் இந்த பகுதியில் உச்ச தீவிரத்தில் குறைவு ஆகியவற்றில் வெளிப்படுகிறது.சுவாரஸ்யமாக, நாம் αS ஐ pLK உடன் தோராயமாக αS செறிவில் கலக்கும்போது.பாலிஎதிலீன் கிளைகோல் (5-15% PEG-8) முன்னிலையில் 5-25 µM (வழக்கமான LLPS இடையக: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) உடனடியாக புரத உருவாக்கம் பற்றிய பரந்த புலத்தை நாங்கள் கடந்து சென்றோம். .ஃப்ளோரசன்ஸ் (WF) மற்றும் பிரகாசமான புலம் (BF) நுண்ணோக்கி (படம் 1c) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நீர்த்துளிகள் காணப்பட்டன.செறிவூட்டப்பட்ட αS (1 µM AlexaFluor488-லேபிளிடப்பட்ட αS, AF488-αS சேர்க்கப்பட்டது) கொண்ட 1-5 µm துளிகள், அவற்றின் மின்னியல் பண்புகள் 10% 1,6-ஹெக்ஸானெடியோல் (1,6-HD) மற்றும் அதன் எதிர்ப்பிலிருந்து பெறப்படலாம். NaCl செறிவு அதிகரிப்பு (படம் 1c).αS/pLK மின்னியல் வளாகத்தின் கோசர்வேட்டுகளின் திரவம் போன்ற தன்மையானது மில்லி விநாடிகளுக்குள் இணைவதன் மூலம் நிரூபிக்கப்படுகிறது (படம் 1d).டர்பிடிமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி, இந்த நிலைமைகளின் கீழ் நீர்த்துளிகள் உருவாவதைக் கணக்கிட்டோம், அதன் நிலைத்தன்மையுடன் (படம் 1e) தொடர்புடைய முக்கிய தொடர்புகளின் மின்னியல் தன்மையை உறுதிசெய்தோம், மேலும் LLPS செயல்பாட்டில் பல்வேறு பாலிமர் விகிதங்களின் விளைவை மதிப்பீடு செய்தோம் (படம் 1f).பரந்த அளவிலான பாலிமர் விகிதங்களில் நீர்த்துளி உருவாக்கம் காணப்பட்டாலும், pLK αS ஐ விட அதிகமாக இருக்கும்போது செயல்முறை மிகவும் சாதகமாக இருக்கும்.வேதியியல் ரீதியாக வேறுபட்ட டிஸ்ப்ளேசிங் ஏஜென்ட் டெக்ஸ்ட்ரான்-70 (70 kDa) அல்லது கண்ணாடி ஸ்லைடு சொட்டுகள், பல்வேறு பொருட்களின் மைக்ரோ பிளேட் கிணறுகள், Eppendorf அல்லது quartz capillaries உள்ளிட்ட பல்வேறு மாதிரி வடிவங்களைப் பயன்படுத்தி LLP களும் காணப்படுகின்றன.
இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் WT-αS மற்றும் ΔCt-αS வகைகளில் வெவ்வேறு புரதப் பகுதிகளின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்.ஆம்பிபாடிக் என்-டெர்மினல் டொமைன், ஹைட்ரோபோபிக் அமிலாய்டு-ஃபார்மிங் (என்ஏசி) பகுதி மற்றும் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட சி-டெர்மினல் டொமைன் ஆகியவை முறையே நீலம், ஆரஞ்சு மற்றும் சிவப்பு நிறங்களில் காட்டப்பட்டுள்ளன.WT-αS இன் மீதிக்கான நிகர கட்டணம் (NCPR) வரைபடம் காட்டப்பட்டுள்ளது.b மேக்ரோமாலிகுலர் க்ளம்புகள் இல்லாத நிலையில் αS/pLK தொடர்புகளின் NMR பகுப்பாய்வு.pLK செறிவு அதிகரிக்கும் போது (αS:pLK மோலார் விகிதங்கள் 1:0.5, 1:1.5, மற்றும் 1:10 முறையே வெளிர் பச்சை, பச்சை மற்றும் அடர் பச்சை நிறத்தில் காட்டப்படுகின்றன).c Coacervate αS/pLK (மொலார் விகிதம் 1:10) 25 µM இல் (1 µM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS அல்லது WF இமேஜிங்கிற்கான Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட pLK) LLPS பஃபரில் (மேல்) அல்லது NaCl 500 மிமீ இடதுபுறம் அல்லது 500 மிமீக்குப் பிறகு கூடுதலாக % 1,6-hexanediol (1,6-HD; கீழ் வலது).அளவுகோல் = 20 µm.d 25 μM செறிவில் αS/pLK (மோலார் விகிதம் 1:10) இன் BF துளி இணைவின் பிரதிநிதி மைக்ரோஸ்கோபிக் படங்கள்;அம்புகள் தனிப்பட்ட சொட்டுகளை (சிவப்பு மற்றும் மஞ்சள் அம்புகள்) ஒரு புதிய துளியாக (ஆரஞ்சு அம்பு) 200 msக்குள் ஒன்றிணைப்பதைக் குறிக்கிறது) .அளவுகோல் = 20 µm.25 µM αS இல் 500 mM NaCl அல்லது 10% 1,6-HD (N = 3 மாதிரி பிரதிகள், சராசரி மற்றும் நிலையான விலகலும் சுட்டிக்காட்டப்படுகிறது) 500 mM NaCl அல்லது 10% 1,6-HD ஐ சேர்ப்பதற்கு முன்னும் பின்னும் எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் e ஒளி சிதறல் (350 nm இல்) αS/pLK திரட்டல்.25 μM αS இல் αS/pLK திரட்டலின் f BF படம் (மேல்) மற்றும் ஒளி சிதறல் பகுப்பாய்வு (350 nm, கீழே) αS: pLK மோலார் விகிதம் (N = 3 மாதிரி பிரதிகள், சராசரி மற்றும் நிலையான விலகலும் சுட்டிக்காட்டப்படுகிறது).அளவுகோல் = 10 µm.ஒரு படத்தின் அளவுகோல் ஒரு பேனலில் உள்ள அனைத்து படங்களின் அளவையும் குறிக்கிறது.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
αS/pLK மின்னியல் சிக்கலான ஒடுக்கம் மற்றும் tau31 உடனான நேரடி தொடர்பு மூலம் tau/RNA மின்தேக்கியின் கிளையன்ட் மூலக்கூறாக αS இன் முந்தைய அவதானிப்புகள் ஆகியவற்றின் அடிப்படையில், αS மற்றும் tau ஆகியவை RNA இல்லாத நிலையில் கரைப்பானுடன் இணைந்து பிரிக்கலாம் என்று நாங்கள் அனுமானித்தோம். ஒடுக்கம்.மின்னியல் வளாகங்கள் மூலம், மற்றும் αS என்பது αS/Tau coacervates இல் உள்ள சாரக்கட்டு புரதமாகும் (படம் 2e இல் tau சார்ஜ் விநியோகத்தைப் பார்க்கவும்).எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் 10 μM αS மற்றும் 10 μM Tau441 (முறையே 1 μM AF488-αS மற்றும் 1 μM Atto647N-Tau ஆகியவற்றைக் கொண்டவை) ஒன்றாகக் கலக்கும்போது, ​​அவை WF மைக்ரோஸ்கோபியால் பார்க்கப்பட்டபடி, இரண்டு புரதங்களையும் கொண்ட புரதத் திரட்டுகளை எளிதாக உருவாக்குவதை நாங்கள் கவனித்தோம்.(படம் 2a).துளிகளில் உள்ள இரண்டு புரதங்களின் கோலோகலைசேஷன் கன்ஃபோகல் (CF) நுண்ணோக்கி (துணை படம் 1a) மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.dextran-70 ஒரு திரட்டல் முகவராகப் பயன்படுத்தப்பட்டபோது இதேபோன்ற நடத்தை காணப்பட்டது (துணை படம் 1c).FITC-லேபிளிடப்பட்ட PEG அல்லது dextran ஐப் பயன்படுத்தி, கூட்ட நெரிசல் முகவர்கள் இரண்டும் மாதிரிகள் முழுவதும் சமமாக விநியோகிக்கப்படுவதைக் கண்டறிந்தோம், பிரித்தல் அல்லது தொடர்பு எதுவும் காட்டப்படவில்லை (துணை படம். 1d).மாறாக, இந்த அமைப்பில் அவை மேக்ரோமாலிகுலர் கூட்ட விளைவுகளின் மூலம் கட்டத்தைப் பிரிப்பதை ஊக்குவிக்கின்றன, ஏனெனில் PEG என்பது மற்ற LLP அமைப்புகளில் காணப்படுவது போல, ஒரு முன்னுரிமை நிலையான கூட்ட முகவர்.இந்த புரதம் நிறைந்த நீர்த்துளிகள் NaCl (1 M) க்கு உணர்திறன் கொண்டவை ஆனால் 1,6-HD (10% v/v) க்கு இல்லை, அவற்றின் மின்னியல் பண்புகளை உறுதிப்படுத்துகிறது (துணை படம். 2a, b).BF நுண்ணோக்கி (படம் 2b) ஐப் பயன்படுத்தி மில்லி விநாடி ஒன்றிணைக்கும் துளி நிகழ்வுகளைக் கவனிப்பதன் மூலம் அவற்றின் திரவ நடத்தை உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.
எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் உள்ள αS/Tau441 கோசர்வேட்களின் கன்ஃபோகல் (CF) நுண்ணோக்கி படங்கள் (ஒவ்வொரு புரதத்திலும் 10 μM, AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS இன் 0.5 μM மற்றும் Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441).b αS/Tau441 துளி இணைவு நிகழ்வுகளின் (ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் 10 μM) பிரதிநிதி வேறுபாடு குறுக்கீடு மாறுபாடு (DIC) படங்கள்.c 50 µM αS இல்லா (இடது) அல்லது முன்னிலையில் (வலது) Tau441 LLPS (0–15 µM) ஒளி சிதறல் (350 nm இல்) அடிப்படையிலான கட்ட வரைபடம்.சூடான நிறங்கள் அதிக சிதறலைக் குறிக்கின்றன.d αS/Tau441 LLPS மாதிரிகளின் ஒளிச் சிதறல் αS செறிவு அதிகரிப்பு (Tau441 at 5 µM, N = 2-3 மாதிரித் திரும்பத் திரும்பச் சுட்டிக்காட்டப்பட்டுள்ளது).e இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் சில டவ் புரத மாறுபாடுகள் மற்றும் புரதத்தின் வெவ்வேறு பகுதிகளின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்: எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட என்-டெர்மினல் டொமைன் (சிவப்பு), ப்ரோலைன் நிறைந்த பகுதி (நீலம்), மைக்ரோடூபுல்-பைண்டிங் டொமைன் (MTBD, ஆரஞ்சு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்பட்டது) மற்றும் அமிலாய்டு-உருவாக்கும் ஜோடி சுழல்.இழை பகுதிகள் (PHF) MTBD (சாம்பல்) க்குள் அமைந்துள்ளது.Tau441 இன் எச்சத்திற்கான நிகர கட்டணம் (NCPR) வரைபடம் காட்டப்பட்டுள்ளது.f 1 µM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும் Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட ΔNt-ஐப் பயன்படுத்துதல், ΔNt-Tau முன்னிலையில் 1 µM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS அல்லது ΔCt-αS ஐப் பயன்படுத்துதல் (ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் மேல், 10 µ0 µ0 புரதத்திற்கு) ) ) எல்எல்பிஎஸ் அல்லது கே18 பஃப்பரில் சுருக்கப்பட்ட WF இன் மைக்ரோகிராஃப்கள்.ஒரு படத்தில் உள்ள ஸ்கேல் பார்கள் ஒரு பேனலில் உள்ள அனைத்து படங்களின் அளவையும் குறிக்கும் (பேனல்கள் a, b மற்றும் f க்கு 20 µm).c மற்றும் d பேனல்களுக்கான மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளாக வழங்கப்படுகிறது.
இந்த LLPS செயல்பாட்டில் αS இன் பங்கைச் சோதிக்க, NaCl (படம் 2c) இன் அதிகரிக்கும் செறிவுகளைப் பயன்படுத்தி நெஃபெலோமெட்ரி மூலம் நீர்த்துளி நிலைத்தன்மையில் αS இன் விளைவை முதலில் ஆராய்ந்தோம்.αS உள்ள மாதிரிகளில் உப்பு செறிவு அதிகமாக இருந்தால், ஒளி சிதறல் மதிப்புகள் (350 nm இல்) அதிகமாக இருக்கும், இது இந்த LLPS அமைப்பில் αS இன் நிலைப்படுத்தும் பங்கைக் குறிக்கிறது.αS செறிவை (எனவே αS:Tau441 விகிதம்) தோராயமாக அதிகரிப்பதன் மூலம் இதேபோன்ற விளைவைக் காணலாம்.டவு செறிவுடன் ஒப்பிடும்போது 10 மடங்கு அதிகரிப்பு (5 µM) (படம் 2d).கோசர்வேட்டுகளில் αS ஒரு சாரக்கட்டு புரதம் என்பதை நிரூபிக்க, எல்எல்பிஎஸ்-சிதைந்த டவு விகாரியின் நடத்தையை ஆராய முடிவு செய்தோம், இதில் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட N-டெர்மினல் பகுதி (எச்சங்கள் 1-150, படம் 2e ஐப் பார்க்கவும்) ΔNt-Tau என்று இல்லை.WF நுண்ணோக்கி மற்றும் நெஃபெலோமெட்ரி ΔNt-Tau தன்னை LLPS (படம் 2f மற்றும் துணை படம் 2d) செய்யவில்லை என்பதை உறுதிப்படுத்தியது 14. இருப்பினும், இந்த துண்டிக்கப்பட்ட Tau மாறுபாட்டின் சிதறல் தீர்வுகளில் αS சேர்க்கப்பட்டபோது, ​​LLPS செயல்முறை முற்றிலும் இருந்தது. ஒத்த நிலைமைகள் மற்றும் புரதச் செறிவுகளின் கீழ் Tau மற்றும் αS இன் முழு அளவிலான தீர்வுகளின் நீர்த்துளி அடர்த்திக்கு நெருக்கமான நீர்த்துளி அடர்த்தியுடன் மீட்டமைக்கப்பட்டது.இந்த செயல்முறையை குறைந்த மேக்ரோமாலிகுலர் கூட்டத்தின் நிலைமைகளிலும் காணலாம் (துணை படம். 2c).எல்எல்பிஎஸ் செயல்பாட்டில் சி-டெர்மினல் αS பகுதியின் பங்கு, ஆனால் அதன் முழு நீளம் அல்ல, சி-டெர்மினல் துண்டிக்கப்பட்ட αS மாறுபாடு (ΔCt- இன் எச்சங்கள் 104-140 (படம். 1a) இல்லாமையைப் பயன்படுத்தி நீர்த்துளி உருவாக்கத்தைத் தடுப்பதன் மூலம் நிரூபிக்கப்பட்டது. αS) புரதம் (படம் 2f மற்றும் துணை படம் 2d).αS மற்றும் ΔNt-Tau இன் கோலோகலைசேஷன் கன்ஃபோகல் ஃப்ளோரசன்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (துணை படம். 1b).
Tau441 மற்றும் αS க்கு இடையேயான LLPS பொறிமுறையை மேலும் சோதிக்க, கூடுதல் Tau மாறுபாடு பயன்படுத்தப்பட்டது, அதாவது மைக்ரோடூபுல்-பைண்டிங் டொமைனில் (MTBD) இணைக்கப்பட்ட ஹெலிகல் ஃபிலமென்ட் கோர் (PHF) துண்டு, இது நான்கு சிறப்பியல்பு ரிபீட் டொமைன்களைக் கொண்டிருந்தால், இது பொதுவாக அறியப்படுகிறது. K18 துண்டாக (படம் 2e ஐப் பார்க்கவும்).மைக்ரோடூபுல்-பைண்டிங் டொமைனுக்கு முந்திய ஒரு வரிசையில் புரோலைன் நிறைந்த டொமைனில் அமைந்துள்ள டவ் புரதத்துடன் αS முன்னுரிமையுடன் பிணைக்கிறது என்று சமீபத்தில் தெரிவிக்கப்பட்டது.இருப்பினும், PHF பகுதி நேர்மறை சார்ஜ் செய்யப்பட்ட எச்சங்களால் நிறைந்துள்ளது (படம் 2e ஐப் பார்க்கவும்), குறிப்பாக லைசின் (15% எச்சங்கள்), இது αS/Tau வளாகத்தின் ஒடுக்கத்திற்கு இந்தப் பகுதியும் பங்களிக்கிறதா என்பதைச் சோதிக்கத் தூண்டியது.சோதனை செய்யப்பட்ட நிபந்தனைகளின் கீழ் K18 மட்டும் LLPS ஐ 100 μM வரையிலான செறிவுகளில் தூண்ட முடியாது என்பதை நாங்கள் கவனித்தோம் (15% PEG அல்லது 20% dextran உடன் LLPS இடையகம்) (படம் 2f).எவ்வாறாயினும், 50 µM αS ஐ 50 µM K18 உடன் சேர்த்தபோது, ​​K18 மற்றும் αS கொண்ட புரதத் துளிகளின் விரைவான உருவாக்கம் நெஃபெலோமெட்ரி (துணை படம். 2d) மற்றும் WF நுண்ணோக்கி (படம் 2f) மூலம் கவனிக்கப்பட்டது.எதிர்பார்த்தபடி, ΔCt-αS ஆல் K18 இன் LLPS நடத்தையை மீட்டெடுக்க முடியவில்லை (படம். 2f).αS/ΔNt-Tau அல்லது αS/Tau441 உடன் ஒப்பிடும்போது எல்.எல்.பி.எஸ்-ஐத் தூண்டுவதற்கு αS/K18 திரட்டலுக்கு சற்றே அதிக புரதச் செறிவு தேவை என்பதை நாங்கள் கவனிக்கிறோம், மற்ற விஷயங்கள் சமமாக இருக்கும்.முன்பு 31 விவரித்தபடி, மைக்ரோடூபுல்-பைண்டிங் டொமைனுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​புரோலைன்-ரிச் டவு டொமைனுடன் αS சி-டெர்மினல் பகுதியின் வலுவான தொடர்புடன் இது ஒத்துப்போகிறது.
αS இல்லாவிட்டாலும் ΔNt-Tau ஆல் LLPS ஐச் செய்ய முடியாது என்பதால், எல்எல்பிஎஸ் அமைப்புகளில் முழு நீள Tau (ஐசோடைப், Tau441/Tau441) மூலம் எளிமையாக இருப்பதால், αS/Tau LLPSஐ வகைப்படுத்துவதற்கான மாதிரியாக இந்த Tau மாறுபாட்டைத் தேர்ந்தெடுத்தோம்.சிக்கலான (ஹீட்டோரோடைபிக், αS/Tau441) திரட்டல் செயல்முறைகளுடன்.αS/Tau மற்றும் αS/ΔNt-Tau அமைப்புகளில் αS திரட்டலின் அளவை (அமுக்கப்பட்ட கட்ட புரதத்தின் ஒரு பகுதியாக, fαS,c) மையவிலக்கு மற்றும் சிதறடிக்கப்பட்ட கட்ட SDS-PAGE பகுப்பாய்வு மூலம் ஒப்பிட்டுப் பார்த்தோம் (பார்க்க 2e), மிகவும் ஒத்த மதிப்புகளைக் கண்டறிந்தோம். அனைத்து புரதங்களுக்கும் ஒரே செறிவு.குறிப்பாக, நாங்கள் முறையே αS/Tau மற்றும் αS/ΔNt-Tau க்கு fαS,c 84 ± 2% மற்றும் 79 ± 7% ஐப் பெற்றோம், இது αS மற்றும் tau க்கு இடையேயான பரம்பரை தொடர்பு, tau மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகளை விட சிறந்தது என்று பரிந்துரைக்கிறது.இடையே.
பல்வேறு பாலிகேஷன்களுடனான தொடர்பு மற்றும் αS இயக்கவியலில் ஒடுக்கம் செயல்முறையின் விளைவு ஆகியவை முதலில் ஃபோட்டோபிளீச்சிங் (FRAP) முறைக்குப் பிறகு ஃப்ளோரசன்ஸ் மீட்பு மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டது.αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau மற்றும் αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS மற்றும் 100 μM Tau441 அல்லது ΔNt-TauK உடன் கூடுதலாக) சோதனை செய்தோம்.மாதிரி கூறுகளை கலந்த பிறகு முதல் 30 நிமிடங்களுக்குள் தரவு பெறப்பட்டது.பிரதிநிதி FRAP படங்கள் (படம். 3a, αS/Tau441 ஒடுக்கம்) மற்றும் அவற்றுடன் தொடர்புடைய நேரப் பாட வளைவுகள் (படம். 3b, துணைப் படம். 3) ஆகியவற்றிலிருந்து, αS இயக்கவியல் Tau441 கோசர்வேட்டுகளைப் போலவே இருப்பதைக் காணலாம்.மற்றும் ΔNt-Tau, இது pLK உடன் மிக வேகமாக இருக்கும்.FRAP (காங் மற்றும் பலர் விவரித்தபடி. 35) கோசர்வேட்டின் உள்ளே αS க்கான கணக்கிடப்பட்ட பரவல் குணகங்கள் D = 0.013 ± 0.009 µm2/s மற்றும் D = 0.026 ± 0.008 µm2/s க்கு αS/Tau-44 αS/ அமைப்பு.pLK, Tau மற்றும் D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, முறையே (படம் 3c).இருப்பினும், சிதறிய கட்டத்தில் பரவல் குணகம் αS என்பது அனைத்து அமுக்கப்பட்ட கட்டங்களை விடவும் பல ஆர்டர்கள் அதிகமாக உள்ளது, ஃப்ளோரசன்ஸ் தொடர்பு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (FCS, துணை படம் 3 ஐப் பார்க்கவும்) அதே நிபந்தனைகளின் கீழ் (LLPS பஃபர்) ஆனால் பாலிகேஷன்கள் இல்லாத நிலையில் தீர்மானிக்கப்படுகிறது. (D = 8 ± 4 µm2/s).எனவே, உச்சரிக்கப்படும் மூலக்கூறு கூட்ட விளைவுகளால் சிதறிய கட்டத்தில் உள்ள புரதங்களுடன் ஒப்பிடும்போது αS மொழிபெயர்ப்பின் இயக்கவியல் கணிசமாகக் குறைக்கப்படுகிறது, இருப்பினும் அனைத்து கோசர்வேட்டுகளும் அவை உருவான முதல் அரை மணி நேரத்தில் திரவம் போன்ற பண்புகளைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன, இது டவு கட்டத்திற்கு மாறாக.pLK மின்தேக்கியில் வேகமான இயக்கவியல்.
a-c FRAP பகுப்பாய்வு αS இயக்கவியல் (2% AF488-லேபிள் αS) மின்னியல் கோசர்வேட்டுகளில்.αS/Tau441 FRAP மதிப்பீடுகளின் மும்மடங்குகளில் உள்ள பிரதிநிதித்துவப் படங்கள் (a) இல் காட்டப்பட்டுள்ளன, இங்கு சிவப்பு வட்டங்கள் நிறமாற்றம் செய்யப்பட்ட பகுதிகளைக் குறிக்கின்றன.அளவுகோல் 5 µm ஆகும்.b சராசரி FRAP வளைவுகள் மற்றும் (c) கணக்கிடப்பட்ட பரவல் குணகங்கள் (D) 5-6 (N) க்கு 100 µM αS மற்றும் Tau441 (சிவப்பு) அல்லது ΔNt-Tau (நீலம்) அல்லது pLK (பச்சை) ஆகியவற்றின் சமநிலை செறிவுகளைப் பயன்படுத்தி மூன்று சோதனைகளிலிருந்து வெவ்வேறு நீர்த்துளிகள் LLPS இன் செறிவு பத்து மடங்கு.FRAP வளைவின் நிலையான விலகல் நிழல் நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது.ஒப்பிடுகையில், சிதறிய கட்டத்தில் பரவல் குணகம் αS ஃப்ளோரசன்ஸ் தொடர்பு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (எஃப்சிஎஸ்) ஐப் பயன்படுத்தி மும்மடங்காக தீர்மானிக்கப்பட்டது (மேலும் தகவலுக்கு துணை படம் 3 மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்).d எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் 100 μM TEMPOL-122-αS இன் தொடர்ச்சியான எக்ஸ்-பேண்ட் EPR ஸ்பெக்ட்ரா எந்த பாலிகேஷன் (கருப்பு) இல்லாமல் அல்லது 100 μM Tau441 (சிவப்பு) அல்லது ΔNt-Tau (நீலம்) அல்லது 1 mM pLK (பச்சை) முன்னிலையில்.மிகவும் வியத்தகு மாற்றங்கள் நிகழும் வலுவான புலக் கோடுகளின் பெரிதாக்கப்பட்ட காட்சியை இன்செட் காட்டுகிறது.எல்எல்பிஎஸ் (PEG இல்லை) இல்லாத நிலையில் பல்வேறு பாலிகேஷன்களுடன் 50 μM TEMPOL-122-αS பிணைப்பு வளைவுகள்.இயல்பாக்கப்பட்ட EPR ஸ்பெக்ட்ரமின் இசைக்குழு II (IIII/III) உடன் ஒப்பிடும்போது பேண்ட் III இன் குறைக்கப்பட்ட வீச்சு, Tau441 (சிவப்பு), ΔNt-Tau (நீலம்) மற்றும் pLK (பச்சை) ஆகியவற்றின் மோலார் விகிதங்களை அதிகரிப்பதாகக் காட்டப்படுகிறது.ஒவ்வொரு வளைவிலும் n ஒரே மாதிரியான மற்றும் சுயாதீனமான பிணைப்பு தளங்களைக் கொண்ட தோராயமான பிணைப்பு மாதிரியைப் பயன்படுத்தி வண்ணக் கோடுகள் தரவுக்கு பொருத்தமாக இருக்கும்.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
ஒரு நிரப்பியாக, டைரக்ட் ஸ்பின் லேபிளிங் (SDSL) மற்றும் தொடர்ச்சியான எலக்ட்ரான் பாரா காந்த அதிர்வு (CW-EPR) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பல்வேறு கோசர்வேட்டுகளில் αS இன் இயக்கவியலை ஆராய்ந்தோம்.இந்த முறையானது IDPயின் நெகிழ்வுத்தன்மை மற்றும் இயக்கவியலை யதார்த்தமான எஞ்சிய தீர்மானம்36,37,38 உடன் அறிக்கையிடுவதில் மிகவும் பயனுள்ளதாக நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.இந்த நோக்கத்திற்காக, நாங்கள் ஒற்றை சிஸ் மரபுபிறழ்ந்தவர்களில் சிஸ்டைன் எச்சங்களை உருவாக்கி, 4-ஹைட்ராக்ஸி-2,2,6,6-டெட்ராமெதில்பிபெரிடைன்-என்-ஆக்சில் (TEMPOL) ஸ்பின் ஆய்வைப் பயன்படுத்தினோம்.Maleimide வழித்தோன்றல்கள் அவற்றை லேபிளிடுகின்றன.இன்னும் குறிப்பாக, 122 அல்லது 24 αS (TEMPOL-122-αS மற்றும் TEMPOL-24-αS) நிலையில் TEMPOL ஆய்வுகளைச் செருகினோம்.முதல் வழக்கில், புரதத்தின் சி-டெர்மினல் பகுதியை குறிவைக்கிறோம், இது பாலிகேஷன்களுடன் தொடர்பு கொள்கிறது.மாறாக, நிலை 24 ஆனது மின்தேக்கியில் உள்ள புரதங்களின் ஒட்டுமொத்த இயக்கவியல் பற்றிய தகவலை நமக்குத் தரலாம்.இரண்டு சந்தர்ப்பங்களிலும், சிதறடிக்கப்பட்ட கட்டத்தின் புரதங்களுக்கு பெறப்பட்ட EPR சமிக்ஞைகள் வேகமாக நகரும் நிலையில் நைட்ராக்சைடு தீவிரவாதிகளுடன் ஒத்துப்போகின்றன.tau அல்லது pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 அல்லது ΔNt-Tau 1:1 என்ற விகிதத்தில் அல்லது 1:10 என்ற விகிதத்தில் pLK) முன்னிலையில் கட்டப் பிரிப்புக்குப் பிறகு, ஒப்பீட்டு உச்ச தீவிரத்தில் அதிகரிப்பு காணப்பட்டது. αS இன் EPR ஸ்பெக்ட்ரம்.இழப்புக் கோடு விரிவடைந்தது, இது நீர்த்த கட்டத்தில் உள்ள புரதத்துடன் ஒப்பிடும்போது நீர்த்துளிகளில் குறைக்கப்பட்ட αS மறுசீரமைப்பு இயக்கவியலைக் குறிக்கிறது (படம். 3d, துணைப் படம். 4a).இந்த மாற்றங்கள் நிலை 122 இல் மிகவும் உச்சரிக்கப்படுகின்றன. நிலை 24 இல் pLK இன் இருப்பு ஆய்வின் இயக்கவியலை பாதிக்கவில்லை, நிலை 122 இல் நிறமாலை கோடு வடிவம் கணிசமாக மாறியது (துணை படம் 4a).ஸ்பின்-லேபிளிடப்பட்ட IDP38,39 இன் இயக்கவியலை விவரிக்க பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஐசோட்ரோபிக் மாதிரியை (துணை படம் 5a) பயன்படுத்தி இரண்டு αS/பாலிகேஷன் அமைப்புகளில் 122 வது நிலையில் ஸ்பெக்ட்ராவை மாதிரியாக்க முயற்சித்தபோது, ​​எங்களால் சோதனை நிறமாலையை மறுகட்டமைக்க முடியவில்லை..24 சுழல் மாறுபாடுகளின் நிலையின் நிறமாலை உருவகப்படுத்துதல் (துணை படம் 5a).பாலிகேஷன்களின் முன்னிலையில் αS இன் சி-டெர்மினல் பகுதியின் சுழல் உள்ளமைவுகளின் இடத்தில் முன்னுரிமை நிலைகள் இருப்பதாக இது அறிவுறுத்துகிறது.சோதனை EPR நிலைமைகளின் கீழ் அமுக்கப்பட்ட கட்டத்தில் αS இன் பகுதியைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது (84 ± 2%, 79 ± 7%, மற்றும் 47 ± 4% αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau மற்றும் αS/pLK, முறையே Sup-பார் தரவு பகுப்பாய்வின் படம் 2e c), EPR முறையால் கண்டறியப்பட்ட விரிவாக்கமானது, αS இன் C-டெர்மினல் பகுதியின் தொடர்புகளை அமுக்கப்பட்ட கட்டத்தில் (TEMPOL-122-ஐப் பயன்படுத்தும் போது முக்கிய மாற்றம்) பல்வேறு பாலிகேஷன்களுடன் பிரதிபலிக்கிறது என்பதைக் காணலாம். αS), மற்றும் புரத ஒடுக்கம் அல்ல.மைக்ரோவிஸ்கோசிட்டி அதிகரிப்பு ஆய்வில் காணப்படுகிறது.எதிர்பார்த்தபடி, எல்.எல்.பி.எஸ் அல்லாத வேறு நிபந்தனைகளின் கீழ் புரதத்தின் EPR ஸ்பெக்ட்ரம் கலவையில் 1 M NaCl சேர்க்கப்படும் போது முழுமையாக மீட்டெடுக்கப்பட்டது (துணை படம். 4b).ஒட்டுமொத்தமாக, CW-EPR ஆல் கண்டறியப்பட்ட மாற்றங்கள் முக்கியமாக αS இன் சி-டெர்மினல் பகுதியின் தொடர்புகளை அமுக்கப்பட்ட கட்டத்தில் பல்வேறு பாலிகேஷன்களுடன் பிரதிபலிக்கின்றன என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது, மேலும் இந்த தொடர்பு Tau ஐ விட pLK உடன் வலுவானதாக தோன்றுகிறது
கோசர்வேட்டில் உள்ள புரதங்களைப் பற்றிய கூடுதல் கட்டமைப்புத் தகவல்களைப் பெற, எல்.எல்.பி.எஸ் அமைப்பை கரைசலில் என்.எம்.ஆர் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்ய முடிவு செய்தோம்.எவ்வாறாயினும், சிதறடிக்கப்பட்ட கட்டத்தில் மீதமுள்ள αS பகுதியை மட்டுமே எங்களால் கண்டறிய முடியும், இது கோசர்வேட்டிற்குள் குறைக்கப்பட்ட புரத இயக்கவியல் மற்றும் என்எம்ஆர் பகுப்பாய்வில் கரைசலின் அடிப்பகுதியில் அடர்த்தியான கட்டம் காரணமாக இருக்கலாம்.NMR (துணை படம். 5c, d) ஐப் பயன்படுத்தி LLPS மாதிரியின் சிதறிய கட்டத்தில் மீதமுள்ள புரதத்தின் அமைப்பு மற்றும் இயக்கவியலை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தபோது, ​​புரதம் pLK மற்றும் ΔNt-Tau முன்னிலையில் கிட்டத்தட்ட ஒரே மாதிரியாக செயல்படுவதை நாங்கள் கவனித்தோம். இது இரண்டாம் நிலை அமைப்பு மற்றும் புரத முதுகெலும்பின் இயக்கவியலில் இருந்தது, இரண்டாம் நிலை இரசாயன மாற்றம் மற்றும் R1ρ தளர்வு பற்றிய சோதனைகள் மூலம் வெளிப்படுத்தப்பட்டது.NMR தரவு, αS இன் சி-டெர்மினஸ், பாலிகேஷன்களுடனான அதன் தொடர்புகளின் காரணமாக, மற்ற புரத வரிசையைப் போலவே, அதன் ஒழுங்கற்ற தன்மையைத் தக்கவைத்துக்கொள்ளும் போது, ​​இணக்கமான நெகிழ்வுத்தன்மையின் குறிப்பிடத்தக்க இழப்பை சந்திக்கிறது.
TEMPOL-122-αS அமுக்கப்பட்ட கட்டத்தில் காணப்பட்ட CW-EPR சிக்னல் விரிவாக்கமானது, பாலிகேஷன்களுடனான புரதத்தின் தொடர்புகளை பிரதிபலிப்பதால், எல்எல்பிஎஸ் இல்லாத நிலையில் பல்வேறு பாலிகேஷன்களுடன் αS இன் பிணைப்புத் தொடர்பை மதிப்பிட EPR டைட்ரேஷனைச் செய்தோம் (திரட்சி இல்லை. இடையக LLPS), நீர்த்த மற்றும் செறிவூட்டப்பட்ட கட்டங்களில் இடைவினைகள் ஒரே மாதிரியாக இருக்கும் என்று பரிந்துரைக்கிறது (இது எங்கள் தரவு, துணை படம். 4a மற்றும் துணை படம். 6 மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளது).பொதுவான திரவம் போன்ற பண்புகள் இருந்தபோதிலும், அனைத்து கோசர்வேட்களும் மூலக்கூறு மட்டத்தில் ஏதேனும் அடிப்படை வேறுபாடு நடத்தையை வெளிப்படுத்துகின்றனவா என்பதைப் பார்ப்பதே குறிக்கோளாக இருந்தது.எதிர்பார்த்தபடி, EPR ஸ்பெக்ட்ரம் பெருகிய பாலிகேஷன் செறிவுடன் விரிவடைந்தது, இது அனைத்து தொடர்பு பங்குதாரர்களின் மூலக்கூறு தொடர்புகளின் காரணமாக மூலக்கூறு நெகிழ்வுத்தன்மை குறைவதை பிரதிபலிக்கிறது (படம். 3e, துணை படம். 6).ΔNt-Tau மற்றும் Tau441 உடன் ஒப்பிடும்போது pLK இந்த செறிவூட்டலை குறைந்த மோலார் விகிதத்தில் (பாலிகேஷன்:αS) அடைந்தது.உண்மையில், தோராயமான பிணைப்பு மாதிரியுடன் n ஒத்த மற்றும் சுயாதீன பிணைப்புத் தளங்களைக் கொண்டு தரவை ஒப்பிடுகையில், pLK இன் வெளிப்படையான விலகல் மாறிலி (~5 μM) என்பது Tau441 அல்லது ΔNt-Tau (~50 μM) அளவைக் காட்டிலும் குறைவான அளவின் வரிசையாகும் என்பதைக் காட்டுகிறது. )µM).இது தோராயமான மதிப்பீடாக இருந்தாலும், தொடர்ச்சியான நேர்மறை மின்னூட்டப் பகுதிகளுடன் கூடிய எளிமையான பாலிகேஷன்களுக்கு αS அதிக ஈடுபாட்டைக் கொண்டுள்ளது என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.αS மற்றும் பல்வேறு பாலிகேஷன்களுக்கு இடையே உள்ள இந்த வேறுபாட்டைக் கருத்தில் கொண்டு, அவற்றின் திரவப் பண்புகள் காலப்போக்கில் வித்தியாசமாக மாறக்கூடும் என்றும், இதனால் வெவ்வேறு LSPT செயல்முறைகளால் பாதிக்கப்படலாம் என்றும் நாங்கள் கருதுகிறோம்.
புரோட்டீன் கோசர்வேட்டிற்குள் அதிக நெரிசலான சூழல் மற்றும் புரதத்தின் அமிலாய்டு தன்மை ஆகியவற்றைக் கருத்தில் கொண்டு, சாத்தியமான LSPT செயல்முறைகளைக் கண்டறிய காலப்போக்கில் கோசர்வேட்டின் நடத்தையை நாங்கள் கவனித்தோம்.BF மற்றும் CF நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி (படம் 4), எதிர்பார்த்தபடி, αS/Tau441 கரைசலில் பெரிய அளவில் உறைந்து கிணறு/ஸ்லைடின் அடிப்பகுதியில் உள்ள மேற்பரப்பை முழுத் துளிகளாகத் தொடர்புகொண்டு ஈரமாக்கும் பெரிய நீர்த்துளிகளை உருவாக்குகிறது (துணை படம் . 7d);இந்த கீழே-உருவாக்கப்பட்ட கட்டமைப்புகளை "புரத ராஃப்ட்ஸ்" என்று அழைக்கிறோம்.இந்த கட்டமைப்புகள் உருகும் திறனைத் தக்கவைத்துக்கொண்டதால் அவை திரவமாகவே இருந்தன (துணை படம். 7b) மேலும் எல்எல்பிஎஸ் தூண்டப்பட்ட பிறகு பல மணிநேரம் பார்க்க முடிந்தது (படம். 4 மற்றும் துணைப் படம். 7c).சமச்சீரற்ற கட்டணங்கள் மற்றும் உயர் மின்னியல் மேற்பரப்பு திறன்கள் கொண்ட மின்னியல் கோசர்வேட்டுகளுக்கு எதிர்பார்த்தபடி, ஈரமாக்கும் செயல்முறை ஹைட்ரோபோபிக் பொருட்களை விட ஹைட்ரோஃபிலிக் மேற்பரப்பில் விரும்பப்படுகிறது (துணை படம். 7a).குறிப்பிடத்தக்க வகையில், αS/ΔNt-Tau coalescence மற்றும் rafting கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது, அதே நேரத்தில் αS/pLK மின்தேக்கிகள் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டன (படம் 4).குறுகிய அடைகாக்கும் நேரத்தில், αS/pLK நீர்த்துளிகள் ஒன்றிணைந்து ஹைட்ரோஃபிலிக் மேற்பரப்பை ஈரப்படுத்த முடிந்தது, ஆனால் இந்த செயல்முறை விரைவாக நிறுத்தப்பட்டது மற்றும் 5 மணிநேர அடைகாக்கும் பிறகு, வரையறுக்கப்பட்ட ஒருங்கிணைப்பு நிகழ்வுகள் மட்டுமே காணப்பட்டன மற்றும் ஈரமாக்கல் எதுவும் காணப்படவில்லை.- ஜெல்-டிரிப் மாற்றம்.
பிரதிநிதி BF (கிரேஸ்கேல் பேனல்கள்) மற்றும் CF (வலது பேனல்கள், பச்சை நிறத்தில் AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS) எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் 100 µM αS (1% ஃப்ளோரசன்ட் லேபிள்) கொண்ட கோசர்வேட் மாதிரிகள் 100 µM Tau441sctop முன்னிலையில் -Tau (நடுவில்) அல்லது 1 mM pLK (கீழே) வெவ்வேறு அடைகாக்கும் நேரங்கள் மற்றும் குவிய உயரம் (z, தட்டின் அடிப்பகுதியில் இருந்து தூரம்).சோதனைகள் ஒரே முடிவுகளுடன் 4-6 முறை ஒருவருக்கொருவர் சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.αS/Tau441 கோசர்வேட்டுகள் 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு ஈரப்படுத்தப்பட்டு, படத்தை விட பெரிய ராஃப்ட்களை உருவாக்குகின்றன.அனைத்து படங்களின் அளவுகோல் 20 µm ஆகும்.
αS/Tau441 LLPS இல் உருவான பெரிய திரவம் போன்ற புரதக் குளங்கள், ஆய்வு செய்யப்பட்ட எந்தப் புரதங்களின் அமிலாய்டு திரட்டலுக்கு வழிவகுக்குமா என்று நாங்கள் கேட்டோம்.αS/Tau441 துளிகளின் முதிர்ச்சியை WF மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் மேலே குறிப்பிட்டுள்ள அதே நிபந்தனைகளின் கீழ் நாங்கள் பின்பற்றினோம், ஆனால் 1 μM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும் Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441 (படம் 5a) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தினோம்.எதிர்பார்த்தபடி, முதிர்வு செயல்முறை முழுவதும் முழுமையான புரத உள்ளூர்மயமாக்கலை நாங்கள் கவனித்தோம்.சுவாரஸ்யமாக, ca இலிருந்து.5 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, ராஃப்டுகளுக்குள் மிகவும் தீவிரமான வட்டமற்ற கட்டமைப்புகள் காணப்பட்டன, அவை "புள்ளிகள்" என்று அழைக்கப்பட்டன, அவற்றில் சில αS உடன் இணைக்கப்பட்டன, மேலும் சில Tau441 இல் செறிவூட்டப்பட்டன (படம் 5a, வெள்ளை அம்புகள்).இந்த புள்ளிகள் αS/ΔNt-Tau ஐ விட αS/ΔNt-Tau க்கு அதிக அளவில் ராஃப்டுகளுக்குள் எப்போதும் காணப்படுகின்றன.pLK மற்றும் Tau அமைப்புகளின் நீர்த்துளிகளில் இணைவு/ஈரமாக்கலுக்கு தகுதியற்ற தனித்த புள்ளிகள் எதுவும் இல்லை.αS மற்றும் Tau441 கொண்ட இந்த கறைகள் அமிலாய்டு போன்ற திரட்டுகளா என்பதைச் சோதிக்க, CF நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி இதேபோன்ற பரிசோதனையை நாங்கள் செய்தோம், அதில் Tau441 Atto647N என பெயரிடப்பட்டது மற்றும் 12.5 μM அமிலாய்டு-குறிப்பிட்ட தியோஃப்ளேவின்-T (ThT) தொடக்கத்தில் இருந்து சேர்க்கப்பட்டது.சாயம்.αS/Tau441 நீர்த்துளிகள் அல்லது ராஃப்ட்களின் ThT-கறை அடைகாக்கும் 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகும் காணப்படவில்லை என்றாலும் (படம். 5b, மேல் வரிசை - புரத ராஃப்டுகளின் மீது மீதமுள்ள நீர்த்துளிகள்), ராஃப்டுகளுக்குள் Atto647N-Tau441 கொண்டிருக்கும் ThT-பாசிட்டிவ் கட்டமைப்புகள் மிகவும் பலவீனமாக இருந்தன.இது முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட புள்ளிகளின் அளவு, வடிவம் மற்றும் இருப்பிடத்தை பிரதிபலிக்கிறது (படம். 5b, நடுத்தர மற்றும் கீழ் வரிசைகள்), புள்ளிகள் வயதான திரவ உறைவுகளில் உருவாகும் அமிலாய்டு போன்ற திரட்டுகளுடன் ஒத்திருக்கலாம் என்று பரிந்துரைக்கிறது.
பல்வேறு அடைகாக்கும் நேரங்களில் WF 25 μM αS மற்றும் குவிய உயரங்கள் (z, வரம்பற்ற கீழிருந்து தூரம்) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும் Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441) எல்எல்பிஎஸ் இடையகத் தட்டுக் கிணற்றில்) .இதேபோன்ற முடிவுகளுடன் ஆறு சோதனைகள் சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441) மற்றும் 12.5 μM thioflavin-T (ThT) முன்னிலையில் 25 μM αS இன் CF மைக்ரோஸ்கோபிக் படம்.எடையுள்ள புரதத் துளிகள் மற்றும் டெபாசிட் செய்யப்பட்ட புரத ராஃப்ட்ஸ் மற்றும் புள்ளிகள் முறையே மேல் மற்றும் நடுத்தர வரிசைகளில் காட்டப்பட்டுள்ளன.கீழ் வரிசையில் 3 சுயாதீன பிரதிகளிலிருந்து ராஃப்ட்ஸ் மற்றும் சொட்டுகளின் படங்களைக் காட்டுகிறது.வெள்ளை அம்புகள் இரண்டு பேனல்களிலும் ThT-நேர்மறை புள்ளிகளைக் குறிக்கின்றன.அனைத்து படங்களின் அளவுகோல் 20 µm ஆகும்.
திரவத்திலிருந்து திட நிலைக்கு மாறும்போது கோசர்வேட் புரோட்டீன் நெட்வொர்க்கில் ஏற்படும் மாற்றங்களை இன்னும் விரிவாக ஆராய, ஃப்ளோரசன்ஸ் லைஃப்டைம் இமேஜிங் (FLIM) மற்றும் Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (படம் 6 மற்றும் துணைப் புள்ளிவிவரங்கள் 8 மற்றும் 9) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தினோம்.அடுக்கு முதிர்ச்சியடைந்த அல்லது திடமான-போன்ற ஒருங்கிணைந்த புரதக் கட்டமைப்பில் புரதம் மற்றும் அதனுடன் இணைக்கப்பட்ட ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுக்கு இடையே நெருங்கிய தொடர்பை ஏற்படுத்துகிறது என்று நாங்கள் கருதுகிறோம், இது சுருக்கப்பட்ட ஆய்வு வாழ்நாளில் (τ) வெளிப்படும். , முன்பு விவரித்தபடி40.,41,42.கூடுதலாக, இரட்டை லேபிளிடப்பட்ட மாதிரிகளுக்கு (AF488 மற்றும் Atto647N முறையே FRET நன்கொடையாளர் மற்றும் ஏற்றுக்கொள்ளும் சாயங்கள்), τ இன் இந்த குறைவு, எல்எஸ்பிடியின் போது கோசர்வேட் ஒடுக்கம் மற்றும் FRET(E) செயல்திறனில் அதிகரிப்புடன் சேர்ந்து கொள்ளலாம்.LLPS αS/Tau441 மற்றும் αS/ΔNt-Tau மாதிரிகளில் ராஃப்ட் மற்றும் ஸ்பாட் உருவாக்கத்தை நாங்கள் கண்காணித்தோம் (எல்எல்பிஎஸ் பஃபரில் உள்ள ஒவ்வொரு புரதத்தின் 25 µM 1 µM AF488 என லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும்/அல்லது Atto647N Tau441 அல்லது Tau என லேபிளிடப்பட்டுள்ளது).AF488 (τ488) மற்றும் Atto647N (τ647N) ஆய்வுகளின் ஒளிரும் ஆயுட்காலம் கோசர்வேட்டுகள் முதிர்ச்சியடையும் போது (படம். 6 மற்றும் துணைப் படம். 8c) சிறிதளவு குறைந்துவிட்ட பொதுவான போக்கை நாங்கள் கவனித்தோம்.சுவாரஸ்யமாக, ராஃப்டுகளுக்குள் உள்ள புள்ளிகளுக்கு இந்த மாற்றம் கணிசமாக மேம்படுத்தப்பட்டது (படம். 6c), புள்ளிகளில் மேலும் புரத ஒடுக்கம் ஏற்பட்டது என்பதைக் குறிக்கிறது.இதற்கு ஆதரவாக, 24 மணிநேர வயதுடைய αS/ΔNt-Tau துளிகளுக்கு ஃப்ளோரசன்ஸின் வாழ்நாளில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றம் எதுவும் காணப்படவில்லை (துணை படம். 8d), துளி ஜெலேஷன் என்பது புள்ளியிடலில் இருந்து வேறுபட்ட ஒரு செயல்முறையாகும், மேலும் இது குறிப்பிடத்தக்க மூலக்கூறு மறுசீரமைப்புடன் இல்லை. உறைவுக்குள்.குறிப்பாக αS/Tau441 அமைப்புக்கு (துணை படம். 8e) புள்ளிகள் வெவ்வேறு அளவுகள் மற்றும் αS இல் மாறுபடும் உள்ளடக்கத்தைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும்.ஸ்பாட் ஃப்ளோரசன்ஸின் ஆயுட்காலம் குறைவதோடு, குறிப்பாக Atto647N என பெயரிடப்பட்ட Tau441 (துணை படம். 8a) மற்றும் αS/Tau441 மற்றும் αS/ΔNt-Tau அமைப்புகளுக்கு அதிக FRET செயல்திறன் அதிகரித்தது, மேலும் ஐந்து மணிநேரம் ஒடுக்கம் குறிக்கிறது. தூண்டிய பிறகு, நிலையான மின்சாரத்தின் உள்ளே உள்ள புரதங்கள் ஒடுக்கப்பட்டன.αS/ΔNt-Tau உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​αS/Tau441 புள்ளிகளில் குறைந்த τ647N மற்றும் சற்றே அதிக τ488 மதிப்புகளைக் கவனித்தோம், அதனுடன் குறைந்த மற்றும் அதிக சீரற்ற FRET மதிப்புகள் உள்ளன.αS/Tau441 அமைப்பில், αS/Tau441 அமைப்பில், கவனிக்கப்பட்ட மற்றும் எதிர்பார்க்கப்படும் αS மிகுதியானது, Tau உடன் ஒப்பிடும்போது பன்முகத்தன்மை வாய்ந்தது, பெரும்பாலும் சப்ஸ்டோய்கியோமெட்ரிக் ஆகும், ஏனெனில் Tau441 தானே LLPS மற்றும் திரட்டலுக்கு உட்படலாம் (துணை) படம். .இருப்பினும், Tau441 மற்றும் αS இரண்டும் இருக்கும்போது, ​​நீர்த்துளிகளின் ஒருங்கிணைப்பு, ராஃப்ட் உருவாக்கம் மற்றும், முக்கியமாக, திரவம் போன்ற கோசர்வேட்டுகளுக்குள் புரதத் திரட்டலின் அளவு அதிகபட்சமாக இருக்கும்.
ஒவ்வொரு புரதத்தின் 25 μM இல் αS/Tau441 மற்றும் αS/ΔNt-Tau இன் வாழ்நாள் ஒளிரும் நுண்ணோக்கி (FLIM) படங்கள் (1 μM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும் 1 μM Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441-TauPS இல் Tau441-Tau.நெடுவரிசைகள் வெவ்வேறு முதிர்வு நேரங்களில் (30 நிமிடம், 5 மணிநேரம் மற்றும் 24 மணிநேரம்) LLPS மாதிரிகளின் பிரதிநிதித்துவப் படங்களைக் காட்டுகின்றன.சிவப்பு சட்டமானது αS/Tau441 புள்ளிகளைக் கொண்ட பகுதியைக் காட்டுகிறது.ஆயுட்காலம் வண்ணப் பட்டைகளாகக் காட்டப்படுகிறது.அனைத்து படங்களுக்கும் ஸ்கேல் பார் = 20 µm.b தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பகுதியின் பெரிதாக்கப்பட்ட FLIM படம், பேனலில் சிவப்பு பெட்டியில் காட்டப்பட்டுள்ளது a.பேனல் a இல் உள்ள அதே வண்ண அளவைப் பயன்படுத்தி வாழ்க்கை வரம்புகள் காட்டப்படுகின்றன.அளவுகோல் = 5 µm.c αS-க்காகப் பதிவுசெய்யப்பட்ட FLIM படங்களில் அடையாளம் காணப்பட்ட வெவ்வேறு புரத இனங்களுக்கான (துளிகள்-D-, ராஃப்ட்-R- மற்றும் ஸ்பெக்கிள்-P) AF488 (αS உடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது) அல்லது Atto647N (Tau உடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளது) காட்டும் வரலாற்று வரைபடங்கள் Tau441 இன் வாழ்நாள் விநியோகம் மற்றும் αS/ΔNt-Tau coacervate மாதிரிகள் (Dக்கு N = 17-32 ROI, Rக்கு 29-44 ROI, மற்றும் புள்ளிகளுக்கு 21-51 ROI).சராசரி மற்றும் இடைநிலை மதிப்புகள் முறையே மஞ்சள் சதுரங்கள் மற்றும் பெட்டிகளுக்குள் கருப்பு கோடுகளாக காட்டப்படுகின்றன.பெட்டியின் கீழ் மற்றும் மேல் எல்லைகள் முறையே முதல் மற்றும் மூன்றாவது காலாண்டுகளைக் குறிக்கின்றன, மேலும் 1.5 மடங்கு இடைவெளி வரம்பிற்குள் (IQR) குறைந்தபட்ச மற்றும் அதிகபட்ச மதிப்புகள் விஸ்கர்களாகக் காட்டப்படுகின்றன.வெளிப்புறங்கள் கருப்பு வைரங்களாகக் காட்டப்படுகின்றன.ஜோடி விநியோகங்களுக்கு இடையேயான புள்ளியியல் முக்கியத்துவம் இரண்டு மாதிரி டி-சோதனையைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டது, சமமற்ற மாறுபாடுகளைக் கருதுகிறது.ஒவ்வொரு ஜோடி ஒப்பிடப்பட்ட தரவிற்கும் இரண்டு முனைகள் கொண்ட டி-டெஸ்ட் p-மதிப்புகள் நட்சத்திரக் குறியீடுகளுடன் காட்டப்படுகின்றன (* p-மதிப்பு > 0.01, ** p-மதிப்பு > 0.001, *** p-மதிப்பு > 0.0001, **** p-மதிப்பு > 0.00001), ns புறக்கணிப்பைக் குறிக்கிறது (p-மதிப்பு > 0.05).சரியான p மதிப்புகள் துணை அட்டவணை 1 இல் கொடுக்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் அசல் தரவு மூல தரவு கோப்புகளாக வழங்கப்படுகின்றன.
புள்ளிகள்/திரள்களின் அமிலாய்டு போன்ற தன்மையை மேலும் நிரூபிக்க, (1 M) NaCl இன் அதிக செறிவுகளுடன் 24 மணிநேரத்திற்கு கறைபடாத கோசர்வேட் மாதிரிகளை சிகிச்சை செய்தோம், இதன் விளைவாக புரத உறைவுகளிலிருந்து திரட்டுகள் பிரிக்கப்பட்டன.அணுசக்தி நுண்ணோக்கியை (AFM) பயன்படுத்தி தனிமைப்படுத்தப்பட்ட திரட்டுகள் (அதாவது, திரட்டுகளின் சிதறிய தீர்வு) காணப்பட்டபோது, ​​15 nm வழக்கமான உயரம் கொண்ட முதன்மையான கோள உருவ அமைப்பைக் கவனித்தோம், இது அதிக உப்பு செறிவு நிலைமைகளின் கீழ் தொடர்புடையது. மேற்பரப்பில் வலுவான ஹைட்ரோபோபிக் விளைவின் காரணமாக பொதுவான அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்களின் நடத்தை (ஃபைப்ரில்கள் பொதுவாக ~10 nm உயரத்தைக் கொண்டிருப்பதைக் கவனிக்கவும்) (துணை படம். 10a).சுவாரஸ்யமாக, ஒரு நிலையான ThT ஃப்ளோரசன்ஸ் மதிப்பீட்டில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட திரட்டுகள் ThT உடன் அடைகாக்கப்பட்டபோது, ​​ThT ஃப்ளோரசன்ஸ் குவாண்டம் விளைச்சலில் வியத்தகு அதிகரிப்பை நாங்கள் கவனித்தோம், சாயமானது வழக்கமான αS அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்களுடன் (துணை படம்) அடைகாக்கப்படும்போது காணப்பட்டதை ஒப்பிடலாம். கோசர்வேட் திரட்டுகளில் அமிலாய்டு போன்ற கட்டமைப்புகள் உள்ளன..உண்மையில், திரட்டுகள் அதிக உப்பு செறிவுகளை பொறுத்துக்கொள்ளும் ஆனால் வழக்கமான அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்கள் (துணை படம். 10c) போன்ற 4 M குவானைடின் குளோரைடுக்கு (GdnHCl) உணர்திறன் கொண்டது.
அடுத்து, ஒற்றை மூலக்கூறு ஃப்ளோரசன்ஸ், குறிப்பிட்ட ஃப்ளோரசன்ஸ் தொடர்பு/குறுக்கு-தொடர்பு நிறமாலை (எஃப்சிஎஸ்/எஃப்சிசிஎஸ்) மற்றும் இரண்டு-வண்ண தற்செயல் கண்டறிதல் (டிசிசிடி) ஆகியவற்றின் வெடிப்பு பகுப்பாய்வு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மொத்தங்களின் கலவையை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம்.இந்த நோக்கத்திற்காக, αS மற்றும் Tau441 (இரண்டும் 25 μM) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 100 μl LLPS மாதிரிகளில் 1 μM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS மற்றும் 1 μM Atto647N-லேபிளிடப்பட்ட Tau441 உடன் 100 μl LLPS மாதிரிகளில் 24 மணிநேர அடைகாப்புக்குப் பிறகு உருவான திரட்டுகளைத் தனிமைப்படுத்தினோம்.எல்.எல்.பி.எஸ் மற்றும் புரோட்டீன் இடையே சாத்தியமான மின்னியல் தொடர்புகளைத் தடுக்க, அதே PEG-இலவச இடையகத்தைப் பயன்படுத்தி, 1 M NaCl (கோசர்வேட்டிலிருந்து திரட்டுகளைப் பிரிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் அதே தாங்கல்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, எல்.எல்.பி.எஸ் மற்றும் புரதத்திற்கு இடையேயான மின்னியல் தொடர்புகளைத் தடுக்க, விளைந்த சிதறடிக்கப்பட்ட மொத்த கரைசலை ஒரு மோனோமாலிகுலர் நிலைக்கு நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.ஒற்றை மூலக்கூறின் நேரப் பாதையின் உதாரணத்தை படம் 7a இல் காணலாம்.FCCS/FCS பகுப்பாய்வு (குறுக்கு-தொடர்பு, CC மற்றும் தன்னியக்க தொடர்பு, AC) மாதிரிகளில் αS மற்றும் tau கொண்ட மொத்தங்கள் ஏராளமாக இருப்பதைக் காட்டுகிறது (படம். 7b, இடது பேனலில் CC வளைவைப் பார்க்கவும்), மேலும் எஞ்சிய மோனோமெரிக் புரதம் அதிகமாக எழுந்தது. நீர்த்த செயல்முறையின் முடிவு (படம் 7b, இடது பேனலில் AC வளைவுகளைப் பார்க்கவும்).மோனோமெரிக் புரதங்களை மட்டுமே கொண்ட மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி அதே தீர்வு நிலைமைகளின் கீழ் நடத்தப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு சோதனைகள் CC வளைவுகளைக் காட்டவில்லை, மேலும் AC வளைவுகள் ஒரு-கூறு பரவல் மாதிரியுடன் (Eq. 4) நன்றாகப் பொருந்துகின்றன, அங்கு மோனோமெரிக் புரதங்கள் எதிர்பார்க்கப்படும் பரவல் குணகங்களைக் கொண்டுள்ளன (படம் 7b. ), வலது குழு).திரட்டப்பட்ட துகள்களின் பரவல் குணகம் 1 µm2/s க்கும் குறைவாக உள்ளது, மேலும் மோனோமெரிக் புரதங்களின் பரவல் குணகம் 1 µm2/s ஆகும்.50-100 µm/s;ஒரே மாதிரியான தீர்வு நிலைமைகளின் கீழ் தனித்தனியாக sonicated αS அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்கள் மற்றும் மோனோமெரிக் αS ஆகியவற்றிற்கான மதிப்புகள் முன்னர் வெளியிடப்பட்ட மதிப்புகளைப் போலவே இருக்கும்.TCCD வெடிப்பு பகுப்பாய்வு (படம் 7c, மேல் குழு) மூலம் மொத்தங்களை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தபோது, ​​ஒவ்வொரு தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மொத்தத்திலும் (αS/Tau heteroaggregate), கண்டறியப்பட்ட மொத்தங்களில் சுமார் 60% αS மற்றும் tau இரண்டையும் கொண்டுள்ளது, சுமார் 30% மட்டுமே உள்ளது. tau, சுமார் 10% αS மட்டுமே.αS/Tau heteroaggregates இன் Stoichiometric பகுப்பாய்வு, பெரும்பாலான பன்முகத்தன்மைகள் tau இல் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது (stoichiometry 0.5 க்குக் கீழே, ஒரு மொத்தத்தில் உள்ள tau மூலக்கூறுகளின் சராசரி எண்ணிக்கை αS மூலக்கூறுகளை விட 4 மடங்கு அதிகம்), இது FLIM இல் நாம் கவனித்த வேலையில் ஒத்துப்போகிறது. பரிசோதனைகள்..FRET பகுப்பாய்வு இந்த திரட்டுகளில் இரண்டு புரதங்களும் இருப்பதாகக் காட்டியது, இருப்பினும் இந்த விஷயத்தில் உண்மையான FRET மதிப்புகள் பெரிய முக்கியத்துவம் வாய்ந்தவை அல்ல, ஏனெனில் ஒவ்வொரு தொகுப்பிலும் ஃப்ளோரோஃபோர்களின் விநியோகம் சோதனையில் பயன்படுத்தப்பட்ட லேபிளிடப்படாத புரதத்தின் அதிகப்படியான காரணமாக சீரற்றதாக இருந்தது.சுவாரஸ்யமாக, 45,46 முதிர்ந்த அமிலாய்டு திரட்டல்-குறைபாடுள்ள Tau மாறுபாட்டைப் பயன்படுத்தி அதே பகுப்பாய்வைச் செய்தபோது (துணை படம். 11a,b ஐப் பார்க்கவும்), αS மின்னியல் திரட்டல் ஒரே மாதிரியாக இருந்தாலும் (துணை படம். 11c, d) கோசர்வேட்டிற்குள் மொத்தங்களை உருவாக்கும் திறன் வெகுவாகக் குறைக்கப்பட்டது மற்றும் சிட்டு சோதனைகளில் FLIM பல இடங்களைக் கண்டறிந்தது, மேலும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மொத்த மாதிரிகளுக்கு பலவீனமான குறுக்கு-தொடர்பு வளைவுகள் காணப்பட்டன.இருப்பினும், ஒரு சிறிய எண்ணிக்கையிலான கண்டறியப்பட்ட திரட்டுகளுக்கு (Tau441 இல் பத்தில் ஒரு பங்கு மட்டுமே), ஒவ்வொரு மொத்தமும் இந்த Tau மாறுபாட்டை விட αS இல் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதை நாங்கள் கவனித்தோம், கண்டறியப்பட்ட திரட்டுகளில் தோராயமாக 50% αS மூலக்கூறுகள் மட்டுமே உள்ளன, மேலும் αS அதிகமாக பன்முகத்தன்மை கொண்டது. .Tau441 (படம் 6f) மூலம் உருவாக்கப்பட்ட பன்முகத் திரட்டுகளுக்கு மாறாக, மொத்தங்கள் (துணை படம் 11e ஐப் பார்க்கவும்).இந்த சோதனைகளின் முடிவுகள், αS தானே கோசர்வேட்டிற்குள் டவ்வுடன் குவியும் திறன் கொண்டதாக இருந்தாலும், இந்த நிலைமைகளின் கீழ் டவு நியூக்ளியேஷன் மிகவும் சாதகமானது, மேலும் இதன் விளைவாக அமிலாய்டு போன்ற திரட்டுகள் αS மற்றும் டௌவின் வடிவமாக செயல்பட முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறது.இருப்பினும், ஒரு tau-ரிச் கோர் உருவாக்கப்பட்டவுடன், αS மற்றும் tau இடையேயான ஹீட்டோரோடைபிக் இடைவினைகள், tau மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான ஹோமோடைபிக் இடைவினைகளை விட மொத்தத்தில் விரும்பப்படுகின்றன;திரவ αS/tau coacervates இல் புரத நெட்வொர்க்குகளையும் நாங்கள் கவனிக்கிறோம்.
αS/Tau441 எலக்ட்ரோஸ்டேடிக் கோசர்வேட்டுகளில் உருவான தனிமைப்படுத்தப்பட்ட திரட்டுகளின் ஒற்றை மூலக்கூறுகளின் பிரதிநிதி ஃப்ளோரசன்ஸின் தற்காலிக தடயங்கள்.மூன்று கண்டறிதல் சேனல்களில் αS/Tau441 coaggregates உடன் தொடர்புடைய வெடிப்புகள் காணப்பட்டன (AF488 மற்றும் Atto647N நேரடி தூண்டுதலுக்குப் பிறகு உமிழ்வு, நீலம் மற்றும் சிவப்பு கோடுகள், மறைமுக தூண்டுதலுக்குப் பிறகு Atto647N உமிழ்வு), FRET, வயலட் கோடு).b LLPS (இடது பேனல்) இலிருந்து பெறப்பட்ட தனிமைப்படுத்தப்பட்ட αS/Tau441 திரட்டுகளின் மாதிரியின் FCS/FCCS பகுப்பாய்வு.AF488 மற்றும் Atto647N க்கான தன்னியக்க தொடர்பு (AC) வளைவுகள் முறையே நீலம் மற்றும் சிவப்பு நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன, மேலும் இரு சாயங்களையும் கொண்ட மொத்தத்துடன் தொடர்புடைய குறுக்கு தொடர்பு (CC) வளைவுகள் ஊதா நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.ஏசி வளைவுகள் பெயரிடப்பட்ட மோனோமெரிக் மற்றும் ஒருங்கிணைந்த புரத இனங்களின் இருப்பை பிரதிபலிக்கின்றன, அதே சமயம் CC வளைவுகள் இரட்டை-லேபிளிடப்பட்ட திரட்டுகளின் பரவலை மட்டுமே காட்டுகின்றன.அதே பகுப்பாய்வு, ஆனால் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட இடங்களில் உள்ள அதே தீர்வு நிலைமைகளின் கீழ், மோனோமெரிக் αS மற்றும் Tau441 ஆகியவற்றைக் கொண்ட மாதிரிகள் வலது பேனலில் கட்டுப்பாடுகளாகக் காட்டப்படுகின்றன.c αS/Tau441 எலக்ட்ரோஸ்டேடிக் கோசர்வேட்டுகளில் உருவான தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மொத்தங்களின் ஒற்றை மூலக்கூறுகளின் ஃப்ளோரசன்ஸ் ஃபிளாஷ் பகுப்பாய்வு.நான்கு வெவ்வேறு மறுநிகழ்வுகளில் (N = 152) காணப்படும் ஒவ்வொரு மொத்தத் தகவல்களும் அவற்றின் ஸ்டோச்சியோமெட்ரி, S மதிப்புகள் மற்றும் FRET செயல்திறன் ஆகியவற்றுக்கு எதிராக திட்டமிடப்பட்டுள்ளது (மேல் குழு, வண்ணப் பட்டை நிகழ்வைப் பிரதிபலிக்கிறது).மூன்று வகையான கூட்டுத்தொகைகளை வேறுபடுத்தி அறியலாம்: -αS-மட்டும் S~1 மற்றும் FRET~0, Tau-மட்டும் கூட்டுத்தொகைகள் S~0 மற்றும் FRET~1, மற்றும் பன்முகத்தன்மை கொண்ட Tau/αS உடன் இடைநிலை S மற்றும் FRET மதிப்பீடுகள் ஒவ்வொரு பன்முகத் தொகுப்பிலும் (N = 100) கண்டறியப்பட்ட இரண்டு மார்க்கர் புரதங்களும் கீழ் பேனலில் காட்டப்பட்டுள்ளன (வண்ண அளவு நிகழ்வைப் பிரதிபலிக்கிறது).மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
திரவ புரதத்தின் முதிர்ச்சி அல்லது முதிர்ச்சியானது ஜெல் போன்ற அல்லது திடமான கட்டமைப்புகளில் காலப்போக்கில் மின்தேக்கியின் பல உடலியல் செயல்பாடுகளில் ஈடுபட்டுள்ளதாகவும், அதே போல் நோய்களிலும், அமிலாய்டு திரட்டலுக்கு முந்திய ஒரு அசாதாரண செயல்முறையாகவும் பதிவாகியுள்ளது 7, 48, 49. இங்கே கட்டப் பிரிப்பு மற்றும் நடத்தை பற்றி விரிவாகப் படிக்கிறோம்.குறைந்த மைக்ரோமொலார் செறிவுகள் மற்றும் உடலியல் ரீதியாக தொடர்புடைய நிலைமைகளில் கட்டுப்படுத்தப்பட்ட சூழலில் சீரற்ற பாலிகேஷன்களின் முன்னிலையில் LSPT αS (αS இன் கணக்கிடப்பட்ட உடலியல் செறிவு >1 µM50 என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ளவும்), வழக்கமான வெப்ப இயக்கவியல் சார்ந்த LPS நடத்தையைப் பின்பற்றுகிறது.உடலியல் pH இல் மிகவும் எதிர்மறையாக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட C-டெர்மினல் பகுதியைக் கொண்டிருக்கும் αS, மின்னியல் செயல்முறையின் மூலம் pLK அல்லது Tau போன்ற அதிக கேடனிக் ஒழுங்கற்ற பெப்டைட்களின் முன்னிலையில் LLPS வழியாக அக்வஸ் கரைசலில் புரதம் நிறைந்த நீர்த்துளிகளை உருவாக்க முடியும் என்பதைக் கண்டறிந்தோம். திரட்டல் மேக்ரோமிகுலூல்களின் முன்னிலையில் சிக்கலான ஒடுக்கம்.இந்த செயல்முறை செல்லுலார் சூழலில் பொருத்தமான விளைவுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும், அங்கு αS அதன் நோயுடன் தொடர்புடைய பல்வேறு பாலிகேஷனிக் மூலக்கூறுகளை விட்ரோ மற்றும் vivo51,52,53,54 ஆகிய இரண்டிலும் சந்திக்கிறது.
பல ஆய்வுகளில், நீர்த்துளிகளுக்குள் உள்ள புரத இயக்கவியல் முதிர்வு செயல்முறையை தீர்மானிக்கும் முக்கிய காரணிகளில் ஒன்றாக கருதப்படுகிறது55,56.பாலிகேஷன்களுடன் கூடிய மின்னியல் αS கோசர்வேட்டுகளில், முதிர்வு செயல்முறை வெளிப்படையாக பாலிகேஷன்களுடனான தொடர்புகளின் வலிமை, வேலன்ஸ் மற்றும் இந்த இடைவினைகளின் பெருக்கத்தைப் பொறுத்தது.சமநிலைக் கோட்பாடு இரண்டு திரவ நிலைகளின் சமநிலை நிலப்பரப்பில் LLPS57,58 ஐ இயக்கும் பயோபாலிமர்கள் நிறைந்த ஒரு பெரிய துளியின் இருப்பு இருக்கும் என்று கூறுகிறது.துளி வளர்ச்சியை ஆஸ்ட்வால்ட் முதிர்வு 59, ஒருங்கிணைப்பு 60 அல்லது சிதறிய கட்டத்தில் இலவச மோனோமரின் நுகர்வு அடையலாம்αS மற்றும் Tau441, ΔNt-Tau அல்லது pLK க்கு, இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட நிபந்தனைகளின் கீழ் பெரும்பாலான புரதம் மின்தேக்கியில் செறிவூட்டப்பட்டது.இருப்பினும், முழு அளவிலான டவு நீர்த்துளிகள் மேற்பரப்பு ஈரமாக்கலின் போது விரைவாக ஒன்றிணைந்தாலும், ΔNt-Tau மற்றும் pLK க்கு நீர்த்துளி ஒருங்கிணைப்பு மற்றும் ஈரமாக்குதல் கடினமாக இருந்தது, இந்த இரண்டு அமைப்புகளிலும் திரவ பண்புகளை விரைவாக இழப்பதை பரிந்துரைக்கிறது.எங்கள் FLIM-FRET பகுப்பாய்வின்படி, வயதான pLK மற்றும் ΔNt-Tau துளிகள் அசல் துளிகளைப் போலவே புரதத் திரட்டலையும் (ஒத்த ஒளிரும் வாழ்நாள் முழுவதும்) காட்டியது, அசல் புரத நெட்வொர்க் மிகவும் கடினமானதாக இருந்தாலும் தக்கவைக்கப்பட்டது என்று பரிந்துரைக்கிறது.
எங்கள் சோதனை முடிவுகளை பின்வரும் மாதிரியில் பகுத்தறிவு செய்கிறோம் (படம் 8).ஆரம்பத்தில் தற்காலிகமாக உருவாக்கப்பட்ட நீர்த்துளிகள் பெரும்பாலும் மின்னியல் இழப்பீடு இல்லாத புரத நெட்வொர்க்குகள் ஆகும், இதனால் மின்னியல் இடைமுகத்தில் மின்னூட்ட ஏற்றத்தாழ்வு பகுதிகள் உள்ளன, இதன் விளைவாக அதிக மின்னியல் மேற்பரப்பு திறன் கொண்ட நீர்த்துளிகள் உருவாகின்றன.கட்டணத்தை ஈடுசெய்ய (பொதுவாக வேலன்ஸ் டிபிளேஷன் என குறிப்பிடப்படும் நிகழ்வு) மற்றும் நீர்த்துளிகளின் மேற்பரப்பு திறனைக் குறைக்க, நீர்த்துளிகள் நீர்த்த கட்டத்தில் இருந்து புதிய பாலிபெப்டைட்களை சேர்க்கலாம், சார்ஜ்-சார்ஜ் இடைவினைகளை மேம்படுத்த புரத நெட்வொர்க்குகளை மறுசீரமைக்கலாம் மற்றும் பிற நீர்த்துளிகளுடன் தொடர்பு கொள்ளலாம்.மேற்பரப்புகளுடன் (ஈரமாக்குதல்).αS/pLK துளிகள், அவற்றின் எளிமையான புரத வலையமைப்பு (αS மற்றும் pLK க்கு இடையேயான பரம்பரை இடைவினைகள் மட்டுமே) மற்றும் புரதம்-புரத இடைவினைகளுக்கான அதிக ஈடுபாடு காரணமாக, மின்தேக்கியின் மின்னூட்டத்தை விரைவாகச் சமன் செய்ய முடிகிறது;உண்மையில், αS/Tau ஐ விட ஆரம்பத்தில் உருவான αS/pLK கோசர்வேட்டுகளில் வேகமான புரத இயக்கவியலைக் கண்டோம்.வேலன்ஸ் குறைபாட்டிற்குப் பிறகு, இடைவினைகள் குறைவாகவே மாறிவிடும் மற்றும் நீர்த்துளிகள் அவற்றின் திரவப் பண்புகளை இழந்து, குறைந்த மின்னியல் மேற்பரப்பு திறன் கொண்ட (எனவே மேற்பரப்பை ஈரப்படுத்த முடியாமல்) ஜெல் போன்ற, எரியாத நீர்த்துளிகளாக மாறும்.இதற்கு நேர்மாறாக, αS/Tau நீர்த்துளிகள் மிகவும் சிக்கலான புரத நெட்வொர்க்குகள் (ஹோமோடைபிக் மற்றும் ஹெட்டோரோடைபிக் இடைவினைகள் இரண்டும்) மற்றும் புரத தொடர்புகளின் பலவீனமான தன்மை காரணமாக நீர்த்துளி சார்ஜ் சமநிலையை மேம்படுத்துவதில் குறைவான செயல்திறன் கொண்டவை.இது நீண்ட காலத்திற்கு திரவ நடத்தையை தக்கவைத்து, அதிக மின்னியல் மேற்பரப்பு திறனை வெளிப்படுத்தும் துளிகளில் விளைகிறது, இது ஒன்றிணைந்து வளர்வதன் மூலம் குறைக்கப்படுகிறது (இதனால் நீர்த்துளிகளின் மேற்பரப்பு / அளவு விகிதத்தை குறைக்கிறது) மற்றும் ஹைட்ரோஃபிலிக் மேற்பரப்பு இரசாயனத்தை ஈரமாக்குகிறது.புரோட்டீன் நெட்வொர்க்கில் சார்ஜ் மேம்படுத்தலுக்கான நிலையான தேடலின் காரணமாக இடைவினைகள் மிகவும் நிலையற்றதாக இருப்பதால், திரவ பண்புகளைத் தக்கவைத்துக்கொள்ளும் பெரிய செறிவூட்டப்பட்ட புரத நூலகங்களை இது உருவாக்குகிறது.சுவாரஸ்யமாக, இயற்கையாக நிகழும் சில ஐசோஃபார்ம்கள்62 உட்பட Tau இன் N-முனையில் துண்டிக்கப்பட்ட வடிவங்கள், இடைநிலை நடத்தையை வெளிப்படுத்துகின்றன, சில αS உடன் வயதாகி நீண்ட கால ஜெல் போன்ற துளிகளாக மாறுகின்றன, மற்றவை பெரிய திரவ மின்தேக்கிகளாக மாறுகின்றன.αS மின்னியல் கோசர்வேட்டுகளின் முதிர்ச்சியில் இந்த இருமைத்தன்மை சமீபத்திய LLPS கோட்பாட்டு மற்றும் சோதனை ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, அவை மின்தேக்கி அளவு மற்றும் திரவ பண்புகளை கட்டுப்படுத்தும் ஒரு திறவுகோலாக மின்தேக்கிகளில் உள்ள மின்னியல் சல்லடைக்கும் இடையே உள்ள தொடர்பை அடையாளம் கண்டுள்ளது.பொறிமுறை 58.61.
இந்தத் திட்டம் எல்எல்பிஎஸ் மற்றும் எல்எஸ்பிடி வழியாக αS மற்றும் Tau441க்கான தூண்டல் அமிலாய்டு திரட்டல் பாதையைக் காட்டுகிறது.கூடுதல் அயனிகள் நிறைந்த (சிவப்பு) மற்றும் கேஷன் நிறைந்த (நீலம்) பகுதிகளுடன், திருப்திகரமான வேலன்ஸ் கொண்ட αS மற்றும் tau மின்னியல் கோசர்வேட்டுகள் குறைந்த மேற்பரப்பு ஆற்றலைக் கொண்டுள்ளன, எனவே குறைந்த ஒருங்கிணைப்பு, இதன் விளைவாக விரைவான நீர்த்துளி வயதானது.ஒரு நிலையான அல்லாத திரட்டப்பட்ட ஜெல் நிலை அடையப்படுகிறது..இந்த நிலைமை αS/pLK அமைப்பின் விஷயத்தில் மிகவும் சாதகமாக உள்ளது, ஏனெனில் அதன் அதிக தொடர்பு மற்றும் எளிமையான புரத-ஜோடி தொடர்பு நெட்வொர்க், இது வேகமான ஜெல் போன்ற மாற்றத்தை அனுமதிக்கிறது.மாறாக, திருப்தியற்ற வேலன்ஸ் கொண்ட நீர்த்துளிகள் மற்றும், அதனால், புரதம் சார்ஜ் செய்யப்பட்ட பகுதிகள் தொடர்பு கொள்ளக் கிடைக்கின்றன, அதன் உயர் மேற்பரப்பு ஆற்றலைக் குறைப்பதற்காக ஹைட்ரோஃபிலிக் மேற்பரப்பை இணைத்து ஈரமாக்குவதை கோசர்வேட் எளிதாக்குகிறது.பலவீனமான Tau-Tau மற்றும் αS-Tau இடைவினைகளைக் கொண்ட பன்முக சிக்கலான வலையமைப்பைக் கொண்ட αS/Tau441 coacervates க்கு இந்த நிலைமை விரும்பத்தக்கது.இதையொட்டி, பெரிய கோசர்வேட்டுகள் அவற்றின் திரவம் போன்ற பண்புகளை மிக எளிதாகத் தக்கவைத்துக்கொள்ளும், இது மற்ற புரத-புரத தொடர்புகளை ஏற்படுத்த அனுமதிக்கிறது.இறுதியில், αS மற்றும் டவு இரண்டையும் கொண்ட அமிலாய்டு பன்முகத் திரட்டுகள் கோசர்வேட் திரவத்திற்குள் உருவாகின்றன, இவை நியூரோடிஜெனரேடிவ் நோய்களின் தனிச்சிறப்புகளாக உள்ள உள்ளடக்கிய உடல்களில் காணப்படும் பொருட்களுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.
αS/Tau441 முதிர்ச்சியடையும் போது உருவாகும் பெரிய திரவம் போன்ற கட்டமைப்புகள் அதிக நெரிசலான ஆனால் மாறும் புரதச்சூழலுடன் மற்றும் குறைந்த அளவிற்கு, αS/ΔNt-Tau coacervates புரதத் திரட்டலின் அணுக்கருவுக்கு ஏற்ற நீர்த்தேக்கங்களாகும்.பெரும்பாலும் αS மற்றும் tau இரண்டையும் கொண்டிருக்கும் இந்த வகை புரதக் கோசர்வேட்டுகளில் திடப் புரதத் திரட்டுகள் உருவாவதை நாம் உண்மையில் அவதானித்துள்ளோம்.இந்த பன்முகத் திரட்டுகள் மின்னியல் அல்லாத இடைவினைகளால் நிலைப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதையும், அமிலாய்டு-குறிப்பிட்ட ThT சாயங்களை வழக்கமான அமிலாய்டு ஃபைப்ரில்களைப் போலவே பிணைக்க முடியும் என்பதையும், உண்மையில் பல்வேறு தாக்கங்களுக்கு ஒத்த எதிர்ப்பைக் கொண்டிருப்பதையும் நாங்கள் காட்டியுள்ளோம்.LLPS ஆல் உருவாக்கப்பட்ட αS/tau திரட்டுகள் அமிலாய்டு போன்ற பண்புகளைக் கொண்டிருப்பதாகக் காட்டப்பட்டது.உண்மையில், அமிலாய்டு திரட்டலில் Tau குறைபாடுள்ள முதிர்ந்த மாறுபாடு, திரவ மின்னியல் கோசர்வேட்டிற்குள் இந்த பன்முகத்தன்மை கொண்ட αS திரட்டுகளை உருவாக்குவதில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் குறைபாடுடையது.αS/Tau441 திரட்டுகளின் உருவாக்கம் கோசர்வேட்டுகளுக்குள் மட்டுமே காணப்பட்டது, அவை திரவம் போன்ற பண்புகளைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன, மேலும் உறைவுகள்/துளிகள் ஜெல் நிலையை அடையவில்லை என்றால்.பிந்தைய வழக்கில், மின்னியல் இடைவினைகளின் அதிகரித்த வலிமை மற்றும் அதன் விளைவாக, புரத வலையமைப்பின் விறைப்பு அமிலாய்டு அணுக்கருவுக்குத் தேவையான புதிய புரத இடைவினைகளை நிறுவ புரதங்களின் தேவையான இணக்க மறுசீரமைப்புகளைத் தடுக்கிறது.இருப்பினும், இது மிகவும் நெகிழ்வான, திரவம் போன்ற கோசர்வேட்டுகளில் அடையப்படலாம், அவை அளவு அதிகரிக்கும் போது திரவமாக இருக்கும்.
சிறிய துளிகளை விட பெரிய αS/Tau கன்டென்சேட்டுகளில் அமுக்கப்பட்ட கட்டத்திற்குள் உருவாக்கம் விரும்பத்தக்கது என்பது, துளிகளின் ஒருங்கிணைப்பைக் கட்டுப்படுத்தும் காரணிகளை அடையாளம் காண்பதன் பொருத்தத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது.எனவே, கட்டப் பிரிப்புக்கான போக்கு மட்டும் இல்லை, ஆனால் மின்தேக்கியின் அளவு சரியான செயல்பாடு மற்றும் நோய் தடுப்புக்கு கட்டுப்படுத்தப்பட வேண்டும்58,61.αS/Tau அமைப்புக்கான LLPS மற்றும் LSPT ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சமநிலையின் முக்கியத்துவத்தையும் எங்கள் முடிவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன.நீர்த்துளி உருவாக்கம், செறிவூட்டல் நிலைகளின் கீழ் கிடைக்கும் புரத மோனோமர்களின் அளவைக் குறைப்பதன் மூலம் அமிலாய்டு திரட்டலுக்கு எதிராகப் பாதுகாக்கும் அதே வேளையில், மற்ற அமைப்புகளில் முன்மொழியப்பட்டது63,64, உயர் துளி அளவுகளில் நீர்த்துளி இணைவு மெதுவான இணக்க மறுசீரமைப்புகள் மூலம் உள் புரதத் திரட்டலுக்கு வழிவகுக்கும்.புரத நெட்வொர்க்குகள்..
ஒட்டுமொத்தமாக, எல்எஸ்பிடியின் சூழலில் டிராப் நெட்வொர்க்குகளில் ஒத்திசைவான வேலன்ஸ் மற்றும் திருப்தியான/திருப்தியற்ற தொடர்புகளின் பொருத்தத்தை எங்கள் தரவு வலுவாக வலியுறுத்துகிறது.குறிப்பாக, முழு நீள αS/Tau441 மின்தேக்கிகள், புரதங்கள் இரண்டையும் உள்ளடக்கிய அமிலாய்டு போன்ற ஹீட்டோரோகிரேகேட்களை உருவாக்குவதற்கும், அணுக்கருவை திறம்பட இணைப்பதற்கும் மற்றும் எங்கள் சோதனை முடிவுகளின் அடிப்படையில் ஒரு மூலக்கூறு பொறிமுறையை முன்மொழிவதற்கும் திறன் கொண்டவை என்பதைக் காட்டுகிறோம்.நாங்கள் இங்கு தெரிவிக்கும் αS/Tau திரவத்தில் உள்ள இரண்டு புரோட்டீன்களின் கூட்டுத்தொகுப்பு உண்மையில் இரண்டு புரதங்களின் இணை-உள்ளூர்மயமாக்கலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம், அவை நோயின் அடையாளங்களாகும், மேலும் LLPS மற்றும் எல்.எல்.பி.எஸ் இடையேயான உறவைப் புரிந்துகொள்வதற்கு பங்களிக்கக்கூடும். அமிலாய்டு திரட்டல், நியூரோடிஜெனரேஷனில் அதிக சார்ஜ் செய்யப்பட்ட IDPக்கு வழி வகுக்கிறது.
மோனோமெரிக் WT-αS, சிஸ்டைன் மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் (Q24C-αS, N122C-αS) மற்றும் ΔCt-αS மாறுபாடுகள் (Δ101-140) E. coli இல் வெளிப்படுத்தப்பட்டு முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி சுத்திகரிக்கப்பட்டது.டிஸல்பைட் பிணைப்பு உருவாவதைத் தடுக்க αS சிஸ்டைன் மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் சுத்திகரிப்புக்கான அனைத்து படிகளிலும் 5 mM DTT சேர்க்கப்பட்டுள்ளது.Tau441 ஐசோஃபார்ம் (Addgene #16316 இலிருந்து பெறப்பட்ட பிளாஸ்மிட்), ΔNt-Tau மாறுபாடு (Δ1–150, ப்ரைமர்கள் CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGGG, 3Δ5AGTTAA) GGCTC5 ப்ரைமருடன் இணைக்கப்பட்டது) E. coli கலாச்சாரங்கள் 37°C மற்றும் 180 rpm இல் OD600 = 0.6–0.7 ஆக வளர்ந்தது, மேலும் வெளிப்பாடு IPTG உடன் 37°C இல் 3 மணி நேரம் தூண்டப்பட்டது.4 °C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு 11,500 xg செல்களை அறுவடை செய்து, 150 mM NaCl கொண்ட உப்புத் தாங்கல் மூலம் கழுவவும்.லிசிஸ் பஃப்பரில் பெல்லட்டை மீண்டும் இணைக்கவும் (1 எல் எல்பிக்கு 20 மில்லி: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, பென்சாமைடின் 50 μM1, copeptin 50 μM1,10 பருப்புகளுக்கு (1 நிமிடம், 1 நிமிடம் ஆஃப்) 80% வீச்சுடன் பனியில் சோனிகேஷன் படி செய்யப்பட்டது.ஒரு அல்ட்ராசவுண்டில் 60 மில்லிக்கு மேல் இல்லை.ஈ.கோலை லைசேட்டுகள் 95° C. வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு சூடேற்றப்பட்டு, பின்னர் பனியில் குளிர்விக்கப்பட்டு, 40 நிமிடங்களுக்கு 127,000×g இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.தெளிவுபடுத்தப்பட்ட சூப்பர்நேட்டண்ட் ஒரு 3.5 kDa சவ்வுக்கு (ஸ்பெக்ட்ரம்™ தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், யுகே) பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் 4 எல் டயாலிசிஸ் பஃபருக்கு எதிராக டயாலிஸ் செய்யப்பட்டது (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 m2 mM, DTT, MGMCl2 , PMSF 0.1 mM) 10 மணிநேரத்திற்கு.5 மில்லி கேஷன் பரிமாற்ற நெடுவரிசை (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) சமநிலை இடையகத்துடன் (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 m) சமநிலைப்படுத்தப்பட்டது.டவ் லைசேட் 0.22 μm PVDF வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டு 1 மில்லி/நிமிட ஓட்ட விகிதத்தில் நெடுவரிசையில் செலுத்தப்பட்டது.எலுஷன் படிப்படியாக மேற்கொள்ளப்பட்டது, டவு 15-30% எலுஷன் பஃபருடன் (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) நீக்கப்பட்டது.பின்னங்கள் SDS-PAGE ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, மேலும் 10 kDa மையவிலக்கு வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி, எதிர்பார்க்கப்படும் மூலக்கூறு எடை கொண்ட ஒரு இசைக்குழுவைக் கொண்ட பின்னங்கள் 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM மற்றும் DTT 2 mM ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு இடையகத்துடன் மாற்றப்பட்டன. இறுதி புரதச் செறிவு 100 μM ஆகும்.புரதக் கரைசல் பின்னர் 0.22 μm PVDF வடிகட்டி வழியாக அனுப்பப்பட்டு, விரைவாக உறைந்து -80 ° C இல் சேமிக்கப்படும்.புரோட்டீன் K18 பேராசிரியர் ஆல்பர்டோ போஃபி அவர்களால் வழங்கப்பட்டது.SDS-PAGE மற்றும் MALDI-TOF/TOF ஆகியவற்றால் உறுதிப்படுத்தப்பட்ட தயாரிப்பின் தூய்மை>95% ஆகும்.பல்வேறு சிஸ்டைன்கள் வேதியியல் ரீதியாக அலெக்ஸாஃப்ளூர்488-மேலிமைடு (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) அல்லது TEMPOL-maleimide (டொராண்டோ ரிசர்ச் கெமிக்கல்ஸ், டொராண்டோ, கனடா) என பெயரிடப்பட்டன.உறிஞ்சுதல் மற்றும் MALDI-TOF/TOF மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau மற்றும் K18 ஆகியவை அதே நடைமுறையைப் பின்பற்றி Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ஐப் பயன்படுத்தி 191 மற்றும் 322 நிலைகளில் உள்ள சொந்த சிஸ்டைன் எச்சங்களுடன் பெயரிடப்பட்டன.αS மற்றும் Tau441க்கான எச்ச வரைபடங்களுக்கான நிகர கட்டணம் CIDER66ஐப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன.
சாலிட் பாலி-எல்-லைசின் (பிஎல்கே டிபி 90-110 சப்ளையர், அலமண்டா பாலிமர்ஸ் இன்க், ஹன்ட்ஸ்வில்லே, அலபாமா, அமெரிக்கா) வழங்கும் என்எம்ஆர் படி 10 எம்எம் ஹெப்ஸ், 100 எம்எம் நாசிஎல், பிஹெச் 7.4 முதல் 10 மிமீ செறிவூட்டப்பட்ட செறிவு ஆகியவற்றில் கரைக்கப்பட்டது. மீயொலி நீர் குளியலில் நிமிடங்கள் மற்றும் -20 ° C இல் சேமிக்கவும்.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) மற்றும் FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ஆகியவை நீரில் கரையக்கூடியவை மற்றும் LLPS பஃபரில் பரவலாக விநியோகிக்கப்படுகின்றன.டயாலிசிஸ் அசுத்தமான உப்புகளை நீக்குகிறது.பின்னர் அவை 0.22 μm துளை அளவு கொண்ட ஒரு சிரிஞ்ச் வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டன, மேலும் அவற்றின் செறிவுகள் ஒரு ரிஃப்ராக்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன (மெட்லர் டோலிடோ, கொலம்பஸ், ஓஹியோ, அமெரிக்கா).பின்வரும் வரிசையில் அறை வெப்பநிலையில் LLPS மாதிரிகள் தயாரிக்கப்பட்டன: தாங்கல் மற்றும் வெளியேற்றம் கலந்தது மற்றும் 1 mM டிரிஸ்(2-கார்பாக்சிதைல்)பாஸ்பைன் (TCEP, கார்போசின்த், காம்ப்டன், UK), 1 mM 2,2,2,2-(எத்தேன்- 1, 2-டைல்டினிட்ரைல்) டெட்ராசெட்டிக் அமிலம் (EDTA, கார்பாக்சின்த்) மற்றும் 1% புரோட்டீஸ் தடுப்பானின் கலவை (PMSF 100 mM, பென்சிமைடு 1 mM, leupeptin 5 μM).பின்னர் αS மற்றும் இணைந்த பாலிகேஷன்கள் (விருப்பங்கள் pLK அல்லது Tau) சேர்க்கப்படும்.தியோஃப்ளேவின்-டி நேரத் தொடர் சோதனைகளுக்கு (ThT, கார்போசிந்த், காம்ப்டன், யுகே), மொத்த ThT செறிவை பாதி αS செறிவூட்டலைப் பயன்படுத்தவும்.மாதிரிகள் ஒரே மாதிரியானவை என்பதை உறுதிப்படுத்த மெதுவாக ஆனால் முழுமையாக கலக்கவும்.முடிவுகள் பிரிவில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, ஒவ்வொரு கூறுகளின் செறிவும் சோதனையிலிருந்து பரிசோதனைக்கு மாறுபடும்.பரிசோதனையின் கால அளவு 4 மணிநேரத்திற்கு அதிகமாகும் போதெல்லாம் 0.02% (w/v) செறிவில் Azide பயன்படுத்தப்பட்டது.எல்.எல்.பி.எஸ் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தும் அனைத்து பகுப்பாய்வுகளுக்கும், பகுப்பாய்விற்கு முன் 5 நிமிடங்களுக்கு கலவையை சமநிலைப்படுத்த அனுமதிக்கவும்.ஒளிச் சிதறல் பகுப்பாய்விற்காக, 150 µl மாதிரிகள் பிணைக்கப்படாத 96-கிணறு மைக்ரோபிளேட்டுகளில் ஏற்றப்பட்டன (µClear®, கருப்பு, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) மற்றும் பிசின் படத்தால் மூடப்பட்டிருக்கும்.கிளாரியோஸ்டார் பிளேட் ரீடரில் (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) கரைசலின் மையத்தில் 350 nm இல் உறிஞ்சுதலை அளவிடுவதன் மூலம் LLP கள் கண்காணிக்கப்பட்டன.சோதனைகள் 25 ° C இல் மும்மடங்காக மேற்கொள்ளப்பட்டன, மேலும் பிழைகள் சராசரியிலிருந்து நிலையான விலகலாக கணக்கிடப்பட்டன.நீர்த்த கட்டமானது மாதிரி மையவிலக்கு மற்றும் SDS-PAGE ஜெல் பகுப்பாய்வு மூலம் அளவிடப்பட்டது, மேலும் நீர்த்த மற்றும் செறிவூட்டப்பட்ட கட்டங்களில் உள்ள αS பின்னம் பல்வேறு LLPS தீர்வுகளில் அளவிடப்பட்டது.100 μl LLPS மாதிரி 1 μM AF488-லேபிளிடப்பட்ட αS ஐ முழுமையாகக் கலந்து 30 நிமிடங்களுக்கு 9600×g இல் மையவிலக்கு செய்ததன் மூலம் தயாரிக்கப்பட்டது, அதன் பிறகு பொதுவாக மழைவீழ்ச்சி தெரியும்.SDS-PAGE ஜெல்லைப் பயன்படுத்தி புரத அளவீட்டுக்கு சூப்பர்நேட்டண்டின் மேல் 50 μl பயன்படுத்தப்பட்டது.கெமிடாக் ஜெல் இமேஜிங் சிஸ்டம் (பயோ-ராட் லேபரேட்டரீஸ், ஹெர்குலிஸ், சிஏ, யுஎஸ்ஏ) பயன்படுத்தி AF488 வடிப்பான்கள் மூலம் ஜெல்கள் ஸ்கேன் செய்யப்பட்டன அல்லது Coomassie ஸ்டைன் மூலம் கறைபட்டு, பொருத்தமான வடிகட்டிகளுடன் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.இதன் விளைவாக வரும் பட்டைகள் ImageJ பதிப்பு 1.53i (National Institutes of Health, USA) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் இரண்டு வெவ்வேறு சோதனைகளில் சோதனைகள் நகல் எடுக்கப்பட்டன.
பொதுவாக, 150 μl மாதிரிகள் பிணைக்கப்படாத 96-கிணறு மைக்ரோபிளேட்டுகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் லைக்கா DMI6000B தலைகீழ் நுண்ணோக்கியில் (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ், வெட்ஸ்லர், ஜெர்மனி) காட்சிப்படுத்தப்பட்டது.ஸ்பாட் பரிசோதனைகளுக்கு, µ-ஸ்லைடு ஆஞ்சியோஜெனெசிஸ் தகடுகள் (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ஜெர்மனி) அல்லது 96-கிணறு பாலிஸ்டிரீன் மைக்ரோபிளேட்டுகள் (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) பயன்படுத்தப்பட்டன.EL6000 ஆலசன் அல்லது பாதரச உலோக ஹாலைடு விளக்குகள் வெளிச்ச ஆதாரங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (முறையே BF/DIC மற்றும் WF இமேஜிங்கிற்கு).WF நுண்ணோக்கிக்கு, 40x உருப்பெருக்க காற்று நோக்கம் (லைக்கா மைக்ரோசிஸ்டம்ஸ், ஜெர்மனி) மாதிரியில் ஒளியை மையப்படுத்தி அதை சேகரிக்க பயன்படுத்தப்பட்டது.AF488 மற்றும் ThT என பெயரிடப்பட்ட மாதிரிகளுக்கு, நிலையான GFP வடிகட்டி தொகுப்புகள், தூண்டுதல் மற்றும் உமிழ்வு பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டிகள், முறையே, 460-500 nm மற்றும் 512-542 nm பேண்ட்பாஸ் ஃபில்டர்கள் மற்றும் 495 nm டைக்ரோயிக் கண்ணாடியுடன் கூடிய வடிகட்டி தூண்டுதல் மற்றும் உமிழ்வு.Atto647N என பெயரிடப்பட்ட மாதிரிகளுக்கு, கிளர்ச்சி மற்றும் உமிழ்வு பேண்ட்பாஸ் வடிகட்டிகள் முறையே 628-40 nm மற்றும் 692-40 nm கொண்ட Cy5 வடிப்பான்கள் மற்றும் 660 nm இருக்ரோயிக் கண்ணாடி பயன்படுத்தப்பட்டது.BF மற்றும் DIC நுண்ணோக்கிக்கு, அதே பிரதிபலித்த ஒளி சேகரிப்பு நோக்கத்தைப் பயன்படுத்தவும்.சேகரிக்கப்பட்ட ஒளி ஒரு லைக்கா DFC7000 CCD கேமராவில் (Leica Microsystems, Germany) பதிவு செய்யப்பட்டது.வெளிப்பாடு நேரம் BF மற்றும் DIC மைக்ரோஸ்கோபி இமேஜிங்கிற்கு 50 ms மற்றும் WF மைக்ரோஸ்கோபி இமேஜிங்கிற்கு 20-100 ms ஆகும்.ஒப்பிடுகையில், ThT உடனான அனைத்து சோதனைகளின் வெளிப்பாடு நேரம் 100 ms ஆகும்.பல நிமிடங்களுக்கு ஒவ்வொரு 100 எம்.எஸ்.களுக்கும் படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டு, நீர்த்துளிகளின் ஒருங்கிணைப்பைக் காட்சிப்படுத்த நேரம் தவறிய சோதனைகள் செய்யப்பட்டன.பட பகுப்பாய்விற்கு ImageJ (NIH, USA) பயன்படுத்தப்பட்டது.இதேபோன்ற முடிவுகளுடன் சோதனைகள் மும்மடங்காக மேற்கொள்ளப்பட்டன.
கோலோகலைசேஷன் சோதனைகள், FRAP மற்றும் 3D புனரமைப்புக்காக, ZEN 2 நீல பதிப்பைப் பயன்படுத்தி Zeiss LSM 880 தலைகீழ் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப்பில் படங்கள் பெறப்பட்டன (கார்ல் ஜெய்ஸ் ஏஜி, ஓபர்கோசென், ஜெர்மனி).50 µl மாதிரிகள் µ-ஸ்லைடு ஆஞ்சியோஜெனிசிஸ் பெட்ரி உணவுகளுக்கு (இபிடி ஜிஎம்பிஹெச், க்ரோஃபெல்ஃபிங், ஜெர்மனி) பயன்படுத்தப்பட்டன, ஹைட்ரோஃபிலிக் பாலிமருடன் (ஐபிட்ரீட்) சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு, 63× ஆயில் அமிர்ஷன் குறிக்கோளில் (பிளான்-அபோக்ரோமேட் 1.4/இல்) பொருத்தப்பட்டது DIC இல்).458 nm, 488 nm, மற்றும் 633 nm ஆர்கான் லேசர் கோடுகளைப் பயன்படுத்தி படங்கள் பெறப்பட்டன மற்றும் 638–755 nm முறையே ThT, AF488 மற்றும் Atto647N ஆகியவற்றைக் காட்சிப்படுத்தப் பயன்படுத்தப்பட்டது.FRAP சோதனைகளுக்கு, ஒவ்வொரு மாதிரியின் நேரமின்மை புகைப்படம் வினாடிக்கு 1 சட்டத்தில் பதிவு செய்யப்பட்டது.இதேபோன்ற முடிவுகளுடன் அறை வெப்பநிலையில் சோதனைகள் மும்மடங்காக மேற்கொள்ளப்பட்டன.அனைத்து படங்களும் ஜென் 2 நீல பதிப்பு மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன (கார்ல் ஜெய்ஸ் ஏஜி, ஓபர்கோசென், ஜெர்மனி).FRAP வளைவுகள் இயல்பாக்கப்பட்டு, திட்டமிடப்பட்டு, OriginPro 9.1 ஐப் பயன்படுத்தி Zen 2 ஐப் பயன்படுத்தி படங்களிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட தீவிரம்/நேரத் தரவுகளுக்குப் பொருத்தப்பட்டன.மீட்டெடுப்பு வளைவுகள் ஒரு மோனோ-அதிவேக மாதிரியுடன் மூலக்கூறு பரவலைக் கணக்கிட்டு, கையகப்படுத்தல் ப்ளீச்சிங் விளைவைக் கணக்கிட கூடுதல் அதிவேக காலத்துடன் பொருத்தப்பட்டன.காங் மற்றும் பலர் சமன்பாட்டில் உள்ளதைப் போல, பெயரளவு ப்ளீச்சிங் ஆரம் மற்றும் முன்னர் தீர்மானிக்கப்பட்ட மீட்பு அரை-வாழ்க்கையைப் பயன்படுத்தி D ஐக் கணக்கிட்டோம்.5 35 காட்டப்பட்டுள்ளது.
αS இன் ஒற்றை சிஸ்டைன் மாறுபாடுகள் 24 (TEMPOL-24-αS) மற்றும் 122 (TEMPOL-122-αS) நிலைகளில் 4-ஹைட்ராக்ஸி-2,2,6,6-டெட்ராமெதில்பைபெரிடைன்-N-ஆக்சில் (TEMPOL) உடன் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது. முறையே.EPR சோதனைகளுக்கு ஸ்பின் லேபிளிங், αS செறிவு 100 μM ஆகவும், PEG செறிவு 15% (w/v) ஆகவும் அமைக்கப்பட்டது.பல்வேறு திரட்டல் நிலைமைகளுக்கு, αS:pLK விகிதம் 1:10 ஆக இருந்தது, அதே சமயம் αS:ΔNt-Tau மற்றும் αS:Tau441 விகிதங்கள் 1:1 இல் பராமரிக்கப்பட்டது.கூட்டம் இல்லாத நிலையில் பைண்டிங் டைட்ரேஷன் சோதனைகளுக்கு, TEMPOL-122-αS 50 μM இல் பராமரிக்கப்பட்டது மற்றும் பாலிகேஷன்கள் அதிகரிக்கும் செறிவுகளில் டைட்ரேட் செய்யப்பட்டு, ஒவ்வொரு நிபந்தனையையும் தனித்தனியாக தயார் செய்கின்றன.CW-EPR அளவீடுகள் ஒரு ப்ரூக்கர் ELEXSYS E580 X-பேண்ட் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டன, ப்ரூக்கர் ER4118 SPT-N1 ரெசனேட்டர் ~9.7 GHz மைக்ரோவேவ் (SHF) அதிர்வெண்ணில் இயங்குகிறது.வெப்பநிலை 25 ° C இல் அமைக்கப்பட்டது மற்றும் ஒரு திரவ நைட்ரஜன் கிரையோஸ்டாட் மூலம் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது.நிறமாலை 4 மெகாவாட் ஆற்றல், 0.1 எம்டி மாடுலேஷன் அலைவீச்சு மற்றும் 100 கிலோஹெர்ட்ஸ் பண்பேற்றம் அதிர்வெண் ஆகியவற்றில் நிறைவுறா நிலைமைகளின் கீழ் பெறப்பட்டது.Tau441 அல்லது ΔNt-Tau (அசல் புரதக் கரைசல்களில் உள்ளது) கொண்ட மாதிரிகளில் எஞ்சிய செறிவுகளைக் குறைக்கும் முகவர்கள் காரணமாக மாதிரிகள் மற்றும் சாத்தியமான சுழல் குறைப்பு ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான சுழல் செறிவுகளில் உள்ள வேறுபாடுகளைத் தவிர்க்க ஸ்பெக்ட்ரல் தீவிரங்கள் இயல்பாக்கப்பட்டன.Matlab®67 இல் செயல்படுத்தப்பட்ட ஈஸிஸ்பின் மென்பொருளைப் (v. 6.0.0-dev.34) பயன்படுத்தி ஈபிஆர் ஸ்பெக்ட்ரல் மாடலிங் செய்ததன் விளைவாக g இன் கொடுக்கப்பட்ட மதிப்புகள் பெறப்பட்டன.ஒன்று/இரண்டு கூறு ஐசோட்ரோபிக் மாதிரிகள் தரவை மாதிரியாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன.அனைத்து சமிக்ஞைகளையும் இயல்பாக்கிய பிறகு, ஒவ்வொரு உருவகப்படுத்துதலையும் தொடர்புடைய சோதனை நிறமாலையிலிருந்து கழிப்பதன் மூலம் எச்சங்கள் கணக்கிடப்பட்டன.பைண்டிங் டைட்ரேஷன் பகுப்பாய்விற்கு, இயல்பான EPR ஸ்பெக்ட்ரம் (IIII/III) இன் இரண்டாவது பேண்டின் மூன்றாவது பேண்டின் ஒப்பீட்டு தீவிரம் αS உடன் பாலிகேஷன்களின் பிணைப்பைக் கண்காணிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது.விலகல் மாறிலியை (Kd) மதிப்பிடுவதற்கு, இதன் விளைவாக வரும் வளைவு n ஒத்த மற்றும் சுயாதீன பிணைப்பு தளங்களைக் கருதி தோராயமான மாதிரியில் பொருத்தப்பட்டது.
என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி சோதனைகள் ஒரு ப்ரூக்கர் நியோ 800 மெகா ஹெர்ட்ஸ் (1எச்) என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி, கிரையோபிரோப் மற்றும் இசட்-கிரேடியன்ட் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டன.அனைத்து சோதனைகளும் 130-207 µM αS மற்றும் 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ஆகியவற்றில் தொடர்புடைய αS/ΔNt-Tau மற்றும் pLK ஐப் பயன்படுத்தி 15 ° C இல் செய்யப்பட்டன.LPS ஐ NMR மூலம் கண்காணிக்க, முன் கலந்த மாதிரிகளில் 10% PEG சேர்க்கப்பட்டது.இரசாயன மாற்றம் இடையூறு சதி (படம். 1b) சராசரி 1H மற்றும் 15N இரசாயன மாற்றங்களைக் காட்டுகிறது.αS 2D1H-15N HSQC ஸ்பெக்ட்ரா முந்தைய பணியின் (BMRB நுழைவு #25227) அடிப்படையில் ஒதுக்கப்பட்டது மற்றும் HNCA, HNCO மற்றும் CBCAcoNH இன் 3D ஸ்பெக்ட்ராவைப் பதிவுசெய்து பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.13Cα மற்றும் 13Cβ இரசாயன மாற்றங்கள் ΔNt-Tau அல்லது pLK முன்னிலையில் கணக்கிடப்பட்டது, தூய சீரற்ற சுருள் இணக்கம் 68 (துணை படம் 5c) இல் αS இரசாயன மாற்றங்களுடன் ஒப்பிடும்போது இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பு போக்குகளில் சாத்தியமான மாற்றங்களை அளவிடுவதற்கு.R1ρ விகிதங்கள் 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, மற்றும் 800 ms தாமதங்களுடன் hsqctretf3gpsi சோதனைகளை (ப்ரூக்கர் நூலகத்திலிருந்து பெறப்பட்டது) பதிவு செய்வதன் மூலம் அளவிடப்பட்டன, மேலும் அதிவேக செயல்பாடுகள் வெவ்வேறு தாமதங்களின் உச்சநிலைக்கு சரிசெய்யப்பட்டன. R1ρ மற்றும் அதன் சோதனை நிச்சயமற்ற தன்மையை தீர்மானிக்க நேரங்கள்.
வணிக நேர-தீர்மான MT200 ஃப்ளோரசன்ஸ் கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியில் (PicoQuant, Berlin, Germany) நேர-தொடர்புடைய ஒற்றை ஃபோட்டான் எண்ணும் (TCSPC) சாதனத்துடன் இரண்டு-வண்ண நேர-தீர்மான ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி சோதனைகள் செய்யப்பட்டன.லேசர் டையோட் ஹெட் பல்ஸ்டு இன்டர்லீவ்டு கிளர்ச்சிக்கு (PIE) பயன்படுத்தப்படுகிறது, பீம் ஒற்றை பயன்முறை அலை வழிகாட்டி வழியாக செல்கிறது மற்றும் 481 nm மற்றும் 637 nm லேசர் கோடுகளுக்கு 10 முதல் 100 nW லேசர் சக்தியுடன் டியூன் செய்யப்படுகிறது.இது ஒரு உகந்த ஃபோட்டான் எண்ணும் விகிதத்தை உறுதிசெய்கிறது, ஃபோட்டான் மாற்றுப்பெயர், ஃபோட்டோபிளீச்சிங் மற்றும் செறிவூட்டல் விளைவுகளைத் தவிர்க்கிறது.μ-ஸ்லைடு ஆஞ்சியோஜெனெசிஸ் கவர்ஸ்லிப்கள் அல்லது தகடுகள் (இபிடி ஜிஎம்பிஹெச், க்ராஃபெல்ஃபிங், ஜெர்மனி) ஒரு சூப்பர் அபோக்ரோமேட் 60x என்ஏ 1.2 லென்ஸின் மேல் அமிர்ஷன் தண்ணீரில் நேரடியாக வைக்கப்பட்டன (ஒலிம்பஸ் லைஃப் சயின்சஸ், வால்தம், அமெரிக்கா).ஒரு 488/640 nm இருக்ரோயிக் கண்ணாடி (Semrock, Lake Forest, IL, USA) முக்கிய பீம் ஸ்ப்ளிட்டராகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.குவிக்கப்படாத கதிர்வீச்சு 50 மைக்ரான் விட்டம் கொண்ட துளையால் தடுக்கப்படுகிறது, பின்னர் குவிக்கப்பட்ட கதிர்வீச்சு 50/50 பீம் ஸ்ப்ளிட்டர் மூலம் 2 கண்டறிதல் பாதைகளாக பிரிக்கப்படுகிறது.பேண்ட்பாஸ் உமிழ்வு வடிகட்டிகள் (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 பச்சை நிற சாயத்திற்கு (AF488) மற்றும் 690/70 சிவப்பு சாயத்திற்கு (Atto647N) டிடெக்டருக்கு முன்னால் பயன்படுத்தப்பட்டன.ஒற்றை-ஃபோட்டான் பனிச்சரிவு டையோட்கள் (SPAD) (மைக்ரோ ஃபோட்டான் சாதனங்கள், போல்சானோ, இத்தாலி) கண்டறியும் கருவிகளாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.வணிக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய SymfoTime64 மென்பொருளைப் (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) பயன்படுத்தி தரவு சேகரிப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு இரண்டும் நிகழ்த்தப்பட்டன.
ஐம்பது மைக்ரோலிட்டர் எல்எல்பிஎஸ் மாதிரிகள் μ-ஸ்லைடு ஆஞ்சியோஜெனெசிஸ் கிணறுகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன (இபிடி ஜிஎம்பிஹெச், க்ராஃபெல்ஃபிங், ஜெர்மனி).இதன் விளைவாக உருவான படங்கள், இடைநிறுத்தப்பட்ட நீர்த்துளிகளுக்கு உகந்த புறநிலை வேலை தூரத்திற்கு கிணற்றின் அடிப்பகுதியில் இருந்து 20 µm வரை குவிக்கப்பட்டுள்ளது மற்றும் ராஃப்ட்கள் மற்றும் புள்ளிகளுக்கு ~1 µm ஆக குறைந்தது 0.25 µm/பிக்சல் அச்சுத் தீர்மானம் மற்றும் 400 µs/பிக்சல் தாமத நேரம்.ஒவ்வொரு சேனலுக்கும் சராசரி பின்னணி சமிக்ஞை தீவிரத்தின் (PBG, சராசரி + 2σ) அடிப்படையில் ஒரு தீவிர வரம்பைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் தரவைத் தேர்ந்தெடுக்கவும், இதனால் திரவ புரதத் துளிகள், ராஃப்ட்ஸ் அல்லது புள்ளிகள் மட்டுமே தேர்ந்தெடுக்கப்படும், சிதறிய கட்டத்தில் இருந்து சாத்தியமான மூலத்தை வடிகட்டவும்.ஒவ்வொரு சேனலின் ஒவ்வொரு இனத்தின் (τ) ஆயுட்காலத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய (AF488 க்கு பச்சை, "g" மற்றும் சிவப்பு, Atto647N க்கு "r"), நாங்கள் நீர்த்துளிகள், ராஃப்ட்ஸ் அல்லது புள்ளிகளைக் கொண்ட ஆர்வமுள்ள பகுதிகளை (ROI கள்) தேர்ந்தெடுத்தோம் (துணை படம் 1 )8b) மற்றும் ஒவ்வொரு சேனலிலும் டெயில்-பிட் பகுப்பாய்வு மற்றும் இரண்டு-கூறு சிதைவு மாதிரியைப் பயன்படுத்தி, அவற்றின் வாழ்நாள் சிதைவை (துளிகள், ராஃப்ட்ஸ் அல்லது புள்ளிகளுக்கு τD, τR மற்றும் τP முறையே துணைப் படம் 8c ஐப் பார்க்கவும்) பொருத்துவதன் மூலம் அவற்றைப் பெற்றனர்.τ இலிருந்து சராசரி τ .பல-அதிவேக பொருத்தத்திற்கு மிகக் குறைவான ஃபோட்டான்களை உருவாக்கிய ROIகள் பகுப்பாய்விலிருந்து விலக்கப்பட்டன.ராஃப்ட்ஸ் மற்றும் புள்ளிகளுக்கு <104 ஃபோட்டான்கள் மற்றும் சொட்டுகளுக்கு 103 கட்ஆஃப் பயன்படுத்தப்பட்டது.நீர்த்துளிகள் குறைந்த வாசலைக் கொண்டுள்ளன, ஏனெனில் அதிக தீவிர மதிப்புகளுடன் சிதைவு வளைவுகளைப் பெறுவது கடினம், ஏனெனில் படப் புலத்தில் உள்ள நீர்த்துளிகள் பொதுவாக சிறியதாகவும் குறைவாகவும் இருக்கும்.ஃபோட்டான் குவிப்பு வரம்பை விட (>500 எண்ணிக்கைகள்/பிக்சல் என அமைக்கப்பட்டது) ஃபோட்டான் எண்ணிக்கையைக் கொண்ட ROIகளும் பகுப்பாய்வுக்காக நிராகரிக்கப்பட்டன.குறைந்தபட்ச IRF குறுக்கீட்டை உறுதிசெய்ய, சேவை வாழ்க்கையின் தொடக்கத்திலிருந்து அதிகபட்சமாக 90% (அதிகபட்சச் சிதைவின் தீவிரத்திற்குப் பிறகு) 90% தீவிரத்துடன் ஆர்வமுள்ள பகுதியிலிருந்து பெறப்பட்ட தீவிரச் சிதைவு வளைவைப் பொருத்தவும். அமைப்புகள் ஒப்பீட்டு நேர சாளரம் ராஃப்ட்ஸ் மற்றும் ஸ்பாட்களுக்கு 25 முதல் 50 ROI மற்றும் சொட்டுகளுக்கு 15-25 ROI பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, குறைந்தது 3 சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து பதிவுசெய்யப்பட்ட 4 க்கும் மேற்பட்ட பிரதிகளிலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட படங்கள்.இனங்களுக்கிடையில் அல்லது கோசர்வேட் அமைப்புகளுக்கு இடையிலான புள்ளிவிவர வேறுபாடுகளை மதிப்பிடுவதற்கு இரண்டு-வால் கொண்ட டி-சோதனைகள் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன.ஆயுட்காலத்தின் (τ) பிக்சல்-பை-பிக்சல் பகுப்பாய்விற்கு, ஒவ்வொரு சேனலுக்கும் புலத்தில் உள்ள வாழ்நாளின் மொத்த அட்டென்யூவேஷன் கணக்கிடப்பட்டது மற்றும் 2/3-கூறு அதிவேக அட்டென்யூவேஷன் மாதிரியின் தோராயமானது மேற்கொள்ளப்பட்டது.ஒவ்வொரு பிக்சலுக்கான வாழ்நாள் அட்டென்யூவேஷன் பின்னர் முன்னர் கணக்கிடப்பட்ட τ மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி பொருத்தப்பட்டது, இதன் விளைவாக ஒரு போலி நிற FLIM ஃபிட் படம் கிடைத்தது.டெயில்-ஃபிட் ஆயுட்கால வரம்பு ஒரே சேனலின் எல்லாப் படங்களிலும் ஒரே மாதிரியாக இருந்தது, மேலும் ஒவ்வொரு சிதைவும் நம்பகமான பொருத்தத்தை வழங்க போதுமான ஃபோட்டான்களை உருவாக்கியது.FRET பகுப்பாய்விற்கு, பிக்சல்கள் 100 ஃபோட்டான்களின் குறைந்த தீவிரம் வாசலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, இது சராசரியாக 11 ஃபோட்டான்களின் பின்னணி சமிக்ஞை (FBG) ஆகும்.ஒவ்வொரு சேனலின் ஃப்ளோரசன் தீவிரமும் சோதனை ரீதியாக நிர்ணயிக்கப்பட்ட திருத்தக் காரணிகளால் சரி செய்யப்பட்டது: 69 ஸ்பெக்ட்ரல் க்ரோஸ்டாக் α 0.004, நேரடி தூண்டுதல் β 0.0305, கண்டறிதல் திறன் γ 0.517.பிக்சல் மட்டத்தில் FRET செயல்திறன் பின்வரும் சமன்பாட்டைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகிறது:
FDD என்பது நன்கொடையாளர் (பச்சை) சேனலில் காணப்பட்ட ஒளிரும் தீவிரம், FDA என்பது மறைமுக தூண்டுதலின் கீழ் ஏற்றுக்கொள்ளும் (சிவப்பு) சேனலில் காணப்பட்ட ஒளிரும் தீவிரம், மற்றும் FAA என்பது ஏற்பி (சிவப்பு) சேனலில் நேரடி தூண்டுதலின் கீழ் காணப்பட்ட ஒளிரும் தீவிரம் ( PIE).ஃப்ளோரசன்ஸ் செறிவு பருப்புகள் சேனலில் காணப்படுகின்றன).
25 µM லேபிளிடப்படாத மோனோமெரிக் Tau441 (25 µM αS உடன் அல்லது இல்லாமல்) உள்ள 100 µl LLPS எதிர்வினை தீர்வுகளை LLPS இடையகத்தில் (மேலே உள்ளவாறு கூடுதலாக) பிசின் ஃபாயில் பூச்சு கொண்ட 96-கிணறு மைக்ரோ பிளேட்டுகளில் வைக்கவும். சமநிலை.10 நிமிடத்திற்குள்.அறை வெப்பநிலையில் 48 மணிநேரம் அடைகாத்த பிறகு, புரத ராஃப்ட்ஸ் மற்றும் புள்ளிகள் இருப்பது உறுதி செய்யப்பட்டது.பின்னர் கிணறுகளில் இருந்து ராஃப்டுகளின் மேல் உள்ள திரவத்தை கவனமாக அகற்றி, பின்னர் 50 எல் டிசோசியேஷன் பஃபர் (10 எம்எம் ஹெப்ஸ், பிஎச் 7.4, 1 எம் நாசிஎல், 1 எம்எம் டிடிடி) சேர்த்து 10 நிமிடம் அடைகாக்கவும்.அதிக உப்பு செறிவு, எஞ்சியிருக்கும் PEG காரணமாக எல்எல்பிஎஸ் மீண்டும் வராது என்பதை உறுதி செய்கிறது, மேலும் மின்னியல் தொடர்புகளால் மட்டுமே உருவாகும் புரதக் கூட்டங்கள் பிரிக்கப்படும்.கிணற்றின் அடிப்பகுதி மைக்ரோபிப்ட் நுனியால் கவனமாக துடைக்கப்பட்டு, அதன் விளைவாக வரும் தீர்வு வெற்று கண்காணிப்பு கிணற்றுக்கு மாற்றப்பட்டது.1 மணிநேரத்திற்கு 50 μM ThT உடன் மாதிரிகளை அடைகாத்த பிறகு, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட புள்ளிகளின் இருப்பு WF நுண்ணோக்கி மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது.pH 7.4 உடன் PBS இல் 70-µM αS கரைசலில் 300 µl, 37 °C மற்றும் 200 rpm இல் சோடியம் அசைட் மற்றும் 200 rpm உடன் 7 நாட்களுக்கு ஒரு ஆர்பிடல் ஷேக்கரில் அடைகாப்பதன் மூலம் sonicated αS ஃபைப்ரில்களை தயார் செய்யவும்.தீர்வு பின்னர் 30 நிமிடங்களுக்கு 9600×g இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது, பிபிஎஸ் pH 7.4 இல் பெல்லட் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டது மற்றும் ஒலிக்கப்பட்டது (1 நிமிடம், 50% சுழற்சி, வைப்ரா-செல் VC130 சோனிகேட்டரில் 80% வீச்சு, சோனிக்ஸ், நியூட்டன், அமெரிக்கா) ஃபைப்ரில் மாதிரிகள் சிறிய ஃபைப்ரில்களின் ஒப்பீட்டளவில் சீரான அளவு விநியோகத்துடன்.
FCS/FCCS பகுப்பாய்வு மற்றும் இரண்டு வண்ண தற்செயல் கண்டறிதல் (TCCD) ஆகியவை PIE பயன்முறையைப் பயன்படுத்தி FLIM-FRET நுண்ணோக்கி சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் அதே MT200 நேர-தீர்மான ஃப்ளோரசன்ட் கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப்பில் (Pico-Quant, Berlin, Germany) செய்யப்பட்டது.இந்த சோதனைகளுக்கான லேசர் சக்தி 6.0 µW (481 nm) மற்றும் 6.2 µW (637 nm) இல் சேர்க்கப்பட்டது.இந்த லேசர் சக்திகளின் கலவையானது, உகந்த எண்ணிக்கை விகிதங்களை அடையும் போது மற்றும் ஃபோட்டோபிளீச்சிங் மற்றும் செறிவூட்டலைத் தவிர்க்கும் போது பயன்படுத்தப்படும் ஃப்ளோரோஃபோர்களின் ஜோடிகளுக்கு ஒத்த பிரகாசத்தை உருவாக்கத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.வணிக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய SymfoTime64 பதிப்பு 2.3 மென்பொருளை (PicoQuant, Berlin, Germany) பயன்படுத்தி தரவு சேகரிப்பு மற்றும் பகுப்பாய்வு இரண்டும் செய்யப்பட்டது.
LLPS ஐப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட தனிமைப்படுத்தப்பட்ட αS/Tau திரட்டுகளின் மாதிரிகள் தனித்தனி இடையகத்தில் பொருத்தமான மோனோமாலிகுலர் செறிவுக்கு நீர்த்தப்படுகின்றன (பொதுவாக ஒரு 1:500 நீர்த்தல், ஏனெனில் கூட்டு மாதிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்படும் போது மொத்த செறிவுகள் ஏற்கனவே குறைவாக இருக்கும்).மாதிரிகள் 1 mg/mL என்ற செறிவில் BSA கரைசலுடன் முன் பூசப்பட்ட கவர்ஸ்லிப்களுக்கு (கார்னிங், USA) நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.
பச்சை மற்றும் சிவப்பு சேனல்களில் உள்ள PIE-smFRET பகுப்பாய்விற்கு, மோனோமெரிக் நிகழ்வுகளால் ஏற்படும் குறைந்த தீவிரம் கொண்ட சமிக்ஞைகளை வடிகட்ட 25 ஃபோட்டான்களின் குறைந்த தீவிரம் வாசலில் பயன்படுத்தப்பட்டது (தனிமைப்படுத்தப்பட்ட தொகுப்புகளுடன் ஒப்பிடும்போது மோனோமர்கள் மொத்த மாதிரிகளை விட அதிகமாக உள்ளன என்பதை நினைவில் கொள்க).பகுப்பாய்விற்கான மொத்தங்களைத் தேர்ந்தெடுக்கும் பொருட்டு, தூய மோனோமர் மாதிரிகளின் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட மோனோமெரிக் αS இன் சராசரி தீவிரத்தை விட ஐந்து மடங்கு இந்த வரம்பு கணக்கிடப்பட்டது.PIE டிரைவ் சர்க்யூட், TSCPC தரவு கையகப்படுத்துதலுடன் இணைந்து, பின்னணி மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரல் க்ரோஸ்டாக்கை அகற்ற உதவும் வாழ்நாள் வெயிட்டிங் வடிப்பானைப் பயன்படுத்துவதை இயக்கியுள்ளது.மேலே உள்ள வரம்புகளைப் பயன்படுத்தி தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட விரிவடைந்த தீவிரம், இடையக-மட்டும் மாதிரிகளின் தீவிரம்/பின் நிகழ்வுகளின் விளக்கப்படங்களிலிருந்து நிர்ணயிக்கப்பட்ட சராசரி பின்னணி சமிக்ஞையைப் பயன்படுத்தி சரி செய்யப்பட்டது.பெரிய திரட்டிகளுடன் தொடர்புடைய வெடிப்புகள் பொதுவாக நேரத் தடத்தில் (1 எம்எஸ் என அமைக்கப்பட்டது) பல தொடர்ச்சியான தொட்டிகளை ஆக்கிரமிக்கின்றன.இந்த சந்தர்ப்பங்களில், அதிகபட்ச வலிமை கொண்ட ஒரு தொட்டி தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.FRET மற்றும் ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் பகுப்பாய்விற்கு, கோட்பாட்டளவில் தீர்மானிக்கப்பட்ட காமா காரணி γ (0.517) பயன்படுத்தப்பட்டது.பயன்படுத்தப்படும் கிளர்ச்சி லேசர் சக்தியில் ஸ்பெக்ட்ரல் க்ரோஸ்டாக் மற்றும் நேரடி தூண்டுதல் பங்களிப்புகள் மிகக் குறைவு (சோதனை ரீதியாக தீர்மானிக்கப்படுகிறது).ஒரு வெடிப்பில் FRET இன் செயல்திறன் மற்றும் ஸ்டோச்சியோமெட்ரி பின்வருமாறு கணக்கிடப்படுகிறது.