347 துருப்பிடிக்காத எஃகு சுருள் குழாய் இரசாயன கூறு, குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (CLMS) ஐப் பயன்படுத்தி நாவல் இன்டர்ஃபெரான்-ரெஸ்பான்சிவ் மனித லிகோசைட் ஆன்டிஜென்-A (HLA-A) சாப்பரோன் புரதங்களை அடையாளம் காணுதல்

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரு ஸ்லைடிற்கு மூன்று கட்டுரைகளைக் காட்டும் ஸ்லைடர்கள்.ஸ்லைடுகளின் வழியாக செல்ல பின் மற்றும் அடுத்த பட்டன்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒவ்வொரு ஸ்லைடையும் நகர்த்த இறுதியில் ஸ்லைடு கன்ட்ரோலர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.

தயாரிப்பு விளக்கம்

துருப்பிடிக்காத எஃகு 347L சுருள் குழாய்கள், எஃகு தரம்: SS347L

இண்டர்ஃபெரான் சிக்னலிங் அமைப்பு சுற்றுச்சூழலில் இருந்து பரவலான நோய்க்கிருமி மற்றும் உள்ளார்ந்த நோயியல் சமிக்ஞைகளுக்கு வலுவான சைட்டோகைன் பதிலைத் தூண்டுகிறது, இதன் விளைவாக இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்களின் துணைக்குழுக்கள் தூண்டப்படுகின்றன.இன்டர்ஃபெரான் தூண்டப்பட்ட புரதங்களின் களத்தில் புதிய புரதம்-புரத தொடர்புகளைக் கண்டறிய டிஎஸ்எஸ்-மத்தியஸ்த கிராஸ்-லிங்க் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (சிஎல்எம்எஸ்) பயன்படுத்தினோம்.எதிர்பார்க்கப்படும் இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்களுடன், MX1, USP18, OAS3 மற்றும் STAT1 போன்ற கேனானிகல் இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்களின் நாவல் இன்டர்மோலிகுலர் மற்றும் இன்ட்ராமாலிகுலர் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட சேர்க்கைகளையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்.கோ-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷனைப் பயன்படுத்தி HLA-A புரதங்களால் (H2BFS-HLA-A-HMGA1) உருவாக்கப்பட்ட இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரத நெட்வொர்க்குகளின் புதிய தொகுப்பின் ஆர்த்தோகனல் சரிபார்ப்பு மற்றும் மூலக்கூறு இயக்கவியல் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி அவற்றின் மேலதிக ஆய்வுகளில் கவனம் செலுத்தினோம்.புரத வளாகத்தின் இணக்க இயக்கவியலின் மாதிரியாக்கம் CLMS கண்டுபிடிப்புகளில் அடையாளம் காணப்பட்ட தொடர்புகளை பிரதிபலிக்கும் பல தொடர்பு தளங்களை வெளிப்படுத்தியது.ஒன்றாக, இண்டர்ஃபெரானால் தூண்டப்பட்ட புதிய சமிக்ஞை வளாகங்களை அடையாளம் காண CLMS இன் பைலட் ஆய்வை நாங்கள் முன்வைக்கிறோம், மேலும் கட்டி நுண்ணிய சூழலில் புரத தொடர்புகளின் புதிய இயக்கவியலை அடையாளம் காண CLMS இன் பரந்த பயன்பாட்டை எதிர்நோக்குகிறோம்.
தகவமைப்பு நோயெதிர்ப்பு மறுமொழி தொடங்கும் முன், ஹோஸ்டின் உள்ளார்ந்த பாதுகாப்பு அமைப்பு, இன்டர்ஃபெரான்கள் (IFNகள்) எனப்படும் சுரக்கும் ஆல்பா-ஹெலிகல் சைட்டோகைன்களின் குடும்பத்தால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட ஆண்டிமைக்ரோபியல் பதிலை ஏற்றுகிறது.வகை I IFN வகுப்புகள் IFNα மற்றும் IFNβ ஆகியவை ஆன்டிவைரல், ப்ரோபோப்டோடிக், புரோஇன்ஃப்ளமேட்டரி மற்றும் ஆன்டிபிரோலிஃபெரேடிவ் நிலைகள் உட்பட செல்லுலார் பதில்களை செயல்படுத்துகின்றன.மனிதர்களில், IFNα இன் 13 துணை வகைகள் அறியப்படுகின்றன, இவை அனைத்தும் குரோமோசோம் 91 இல் தொகுக்கப்பட்டுள்ளன. ஆச்சரியப்படும் விதமாக, மருத்துவ பயன்பாட்டிற்காக IFNα2 மட்டுமே ஆய்வு செய்யப்பட்டுள்ளது.சமீபத்தில், IFNα இன் பிற துணை வகைகள் பற்றிய ஆராய்ச்சிக்கு சிறப்பு கவனம் செலுத்தப்பட்டது.நியமன IFNα2 துணை வகையுடன் ஒப்பிடும்போது HBV2 மற்றும் HIV-13,4 பிரதிகளை கட்டுப்படுத்துவதில் IFNα14 மிகவும் பயனுள்ள ஐசோஃபார்ம்களில் ஒன்றாகும் என்று சமீபத்திய ஆய்வு காட்டுகிறது.
செயல்படுத்தப்பட்ட வகை I இன்டர்ஃபெரான் ஏற்பி வளாகங்கள் (IFNAR1 மற்றும் IFNAR2) ஜானஸ் கைனேஸ்கள் TYK2 மற்றும் JAK15,6 ஆகியவற்றால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட ஒரு சமிக்ஞை கடத்தும் அடுக்கைத் தூண்டுகிறது என்று நிறுவப்பட்டுள்ளது.இந்த ஜானஸ் கைனேஸ்கள் பாஸ்போரிலேட் சிக்னல் டிரான்ஸ்யூசர்கள் மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் புரோட்டீன் ஆக்டிவேட்டர்கள் (STAT1 மற்றும் STAT2) டைரோசின் எச்சங்களில் SH2 டொமைன்-மத்தியஸ்த ஹீட்டோரோடைமரைசேஷனைத் தொடங்குகின்றன.பின்னர், IRF9 ஆனது STAT ஹீட்டோரோடைமர்களை பிணைத்து, IFN-தூண்டப்பட்ட காரணி 3 மரபணுவின் (ISGF3) டிரிமெரிக் வளாகத்தை உருவாக்குகிறது, இது அணுக்கருவுக்கு இடமாற்றம் செய்து 2000க்கும் மேற்பட்ட இண்டர்ஃபெரான்-தூண்டப்பட்ட மரபணுக்களின் (ISGs,8,6,8) படியெடுத்தலைத் தூண்டுகிறது.
ISG கள் உள்ளார்ந்த நோயெதிர்ப்பு மண்டலத்தின் முதுகெலும்பாக அமைகின்றன, குறிப்பாக வைரஸ் தாக்குதலுக்கு பதிலளிக்கும் வகையில்.வைரஸ் தொற்றுக்கு எதிரான பாதுகாப்பின் முதல் வரிசையாக, செல்கள் பரவலான உயிரியல் செயல்பாடுகளுடன் செல்லுலார் புரதங்களின் விரிவான தொடர்புகளை விரைவாக வரிசைப்படுத்துகின்றன.இந்த புரதங்களில் முறை அங்கீகாரம் ஏற்பிகள், சமிக்ஞை மூலக்கூறுகள், டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் மற்றும் நேரடி வைரஸ் எதிர்ப்பு செயல்பாடுகளைக் கொண்ட புரதங்கள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகளின் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாளர்கள் ஆகியவை அடங்கும்.ISG செயல்பாட்டின் பெரும்பாலான தகவல்கள் செயல்பாட்டுத் திரைகளில் இருந்து வருகிறது, அவை அதிகப்படியான அழுத்தத் திரைகள் 10,11 அல்லது மரபணு அமைதிப்படுத்தும் நுட்பங்கள் (siRNA, RNAi மற்றும் CRISPR)12,13, இதில் தனிப்பட்ட ISGகள் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன அல்லது தடுக்கப்படுகின்றன மற்றும் அவற்றின் செயல்பாடு பல்வேறு வைரஸ்களில் சோதிக்கப்படுகிறது.இந்த ஆய்வுகள் தனிப்பட்ட ISG களின் வைரஸ் எதிர்ப்பு பண்புகளை தீர்மானித்திருந்தாலும், ஒவ்வொரு ISG இன் அடிப்படை மூலக்கூறு வழிமுறைகள் பெரும்பாலும் அறியப்படவில்லை.முழுச் செயல்பாட்டை உறுதிப்படுத்த பல புரதங்கள் ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட சைட்டோகைன்களுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன என்பது பொதுவாக ஏற்றுக்கொள்ளப்படுகிறது, எனவே ISGகள் நேரடியாக தொடர்பு கொள்கின்றன அல்லது அவற்றின் தொடர்புகள் செல்லுலார் புரதங்களால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகின்றன.எடுத்துக்காட்டாக, சமீபத்திய ஃபோட்டோகிராஸ்லிங்க்டு புரோட்டியோமிக்ஸ் ஆய்வு ATPase VCP/p97 ஐ ஒரு முக்கிய IFITM3 இன்டராக்ஷன் பார்ட்னராக அடையாளம் கண்டுள்ளது, அதன் தடுப்பு லைசோசோமால் வரிசைப்படுத்துதல், வருவாய் மற்றும் IFITM3 இன் வைரஸ் துகள்கள் 14 உடன் பரிமாற்றம் ஆகியவற்றில் குறைபாடுகளுக்கு வழிவகுக்கிறது.இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷனைப் பயன்படுத்தி, கொலஸ்ட்ரால்-மத்தியஸ்த வைரஸ் முதிர்ச்சியை மத்தியஸ்தம் செய்யும் IFITM1/2/3 உடனான ஒரு தொடர்பு பங்காளியாக VAPA, வெசிகல்-தொடர்புடைய புரதத்தை அடையாளம் கண்டோம், மேலும் இது ஈஸ்ட் டூ-ஹைப்ரிட் அமைப்பைப் பயன்படுத்தி மற்றொரு ஆய்வின் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.அறிவியல் ஆதரவு 15, 16.
நோய்த்தொற்று மற்றும் வீரியம் மிக்க மாற்றத்தை அடக்குவதில் ஈடுபட்டுள்ள ஒரு அடிப்படை உயிரியல் செயல்முறை ஆன்டிஜென் விளக்கக்காட்சி ஆகும், இது முக்கிய ஹிஸ்டோகாம்பேடிபிலிட்டி காம்ப்ளக்ஸ் (MHC) மூலக்கூறுகளால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது.பிளவுபட்ட, முன்கூட்டியே நிறுத்தப்பட்ட அல்லது தவறாக மடிக்கப்பட்ட புரதங்களிலிருந்து பெப்டைடுகள் (8-12 அமினோ அமிலங்கள் நீளம்) MHC-I ஹீட்டோரோடைமரில் ஏற்றப்படுகின்றன (MHC-I கனமான மற்றும் லேசான சங்கிலிகளைக் கொண்டது, β-2-மைக்ரோகுளோபுலின்; β2M) 17,18 .இதன் விளைவாக நிலையான MHC-I ட்ரைமர்கள் செல் மேற்பரப்பிற்கு கொண்டு செல்லப்படுகின்றன, அங்கு அவை CD8+ T செல்களுக்கு (சைட்டோடாக்ஸிக் T செல்கள்) உள்ளக பெப்டைட்களை வழங்குகின்றன.டி செல்கள் இந்த நோய்க்கிருமிகளையும் கட்டி-குறிப்பிட்ட ஆன்டிஜெனைச் சுமந்து செல்லும் செல்களையும் கண்டறிந்து அழிக்கின்றன.இதன் விளைவாக, நோய்க்கிருமிகள் மற்றும் கட்டி செல்கள் நோயெதிர்ப்பு கண்காணிப்பைத் தவிர்ப்பதற்காக ஆன்டிஜென் வழங்கல் செயல்முறையை அடிக்கடி அடக்குகின்றன.கூடுதலாக, MHC-I 40-90% மனிதக் கட்டிகளில் குறைக்கப்படுகிறது மற்றும் பெரும்பாலும் மோசமான முன்கணிப்புடன் தொடர்புடையது.
நோய்க்கிருமிகளுக்கு பதிலளிப்பதில் ஈடுபட்டுள்ள மரபணுக்கள் ஓய்வு நிலைக்கும் செயலில் படியெடுக்கும் நிலைக்கும் இடையில் விரைவாக மாற வேண்டும்.எனவே, பல செல்லுலார் புரதங்கள் குறுகிய காலத்தில் அதிக IFN தேவைக்கு பதிலளிப்பதில் ஈடுபடுவதாக அனுமானிக்கப்படுகிறது, இதில் புரமோட்டர் குரோமாடின் 20,21 இன் மறுவடிவமைப்பு மற்றும் மாற்றியமைக்கப்பட்டது.பெரும்பாலான ஆய்வுகள் IFN முன்னிலையில் தனிப்பட்ட ISG புரதக் கூட்டாளர்களை அடையாளம் காண்பதில் கவனம் செலுத்துகின்றன.மாதிரி செல் அமைப்புகளில் பல புரோட்டியோமிக் மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் ஆய்வுகள் செல்லுலார் நிலப்பரப்பில் IFN இன் விளைவை தெளிவுபடுத்தியுள்ளன.எவ்வாறாயினும், இன்டர்ஃபெரான்களால் தூண்டப்பட்ட இயக்கவியல் பற்றிய வளர்ந்து வரும் புரிதல் இருந்தபோதிலும், ISG களின் ஈடுபாடு பற்றி எங்களுக்கு இன்னும் கொஞ்சம் தெரியும்.இண்டர்ஃபெரான் சிக்னலின் சிக்கலான தன்மை மற்றும் நேரத்தைச் சார்ந்த இயக்கவியலைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​​​இரண்டு கேள்விகள் எழுகின்றன: (i) வேகமான சமிக்ஞையில் ஈடுபட்டுள்ள மல்டிபுரோட்டீன் வளாகங்களை நிலைப்படுத்தவும் சிக்கவைக்கவும் முடியுமா, மேலும் (ii) இந்த இடைவினைகளை 3D விண்வெளியில் வரைபடமாக்க முடியுமா?
இந்தச் சிக்கல்களைத் தீர்க்க, IFNα- தூண்டப்பட்ட புரத தொடர்பு நெட்வொர்க் மற்றும் அதன் இயக்கவியலைப் படிக்க, மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியுடன் (CLMS) டிசுசினிமைடு சப்ரேட்-மத்தியஸ்த வேதியியல் குறுக்கு-இணைப்பை (டிஎஸ்எஸ்) செயல்படுத்தினோம்.விவோவில் உள்ள புரதங்கள் மற்றும்/அல்லது புரத வளாகங்களின் அருகாமையில் உள்ள எச்சங்கள் இடையே கோவலன்ட் பிணைப்புகளை DSS சேர்க்கிறது.அடுத்தடுத்த MS பகுப்பாய்வு குறிப்பிட்ட குறுக்கு இணைப்பு தளங்களை வெளிப்படுத்துகிறது, அவை ஒரு குறிப்பிட்ட புரதத்திற்குள் உள்ள பகுதிகளின் இடஞ்சார்ந்த அருகாமையை பிரதிபலிக்கின்றன, அவை உள் இணைப்புகள் அல்லது புரத வளாகங்களில் உள்ள துணைக்குழுக்கள் என்று அழைக்கப்படுகின்றன.இந்த அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி, பல நாவல் புரத-புரத வளாகங்கள் மற்றும் இன்டர்ஃபெரான் தூண்டப்பட்ட மல்டிபுரோட்டீன் தொடர்பு நெட்வொர்க்குகளை நாங்கள் அடையாளம் கண்டுள்ளோம்.இந்தப் புதிய தொடர்புகளின் துணைக்குழுவை மேலும் சோதிப்பதன் மூலம், H2BFS (H2B ஹிஸ்டோன் வகை FS; இனிமேல் H2B என குறிப்பிடப்படுகிறது) மற்றும் MDN1 ஆகியவை HLA-Aக்கான பிணைப்பு கூட்டாளர்களாக செயல்படுகின்றன என்பதை நாங்கள் நிரூபித்துள்ளோம்.
Flo-1 செல்கள் உணவுக்குழாய் அடினோகார்சினோமாவின் விட்ரோ மாடல்களில் நன்கு அறியப்பட்ட ஒன்றாகும், ஏனெனில் அவை உணவுக்குழாய் கட்டிகளின் முக்கிய அம்சங்களைப் பிரதிபலிக்கின்றன.இருப்பினும், அனைத்து கட்டிகளும் நோய் எதிர்ப்பு சக்தி கொண்டவை அல்ல, மேலும் ஃப்ளோ-1 செல்கள் இண்டர்ஃபெரான் சிகிச்சைக்கு பதிலளிக்கின்றனவா என்பதை தீர்மானிக்க, ஃப்ளோ-1 செல்களை 10 ng/ml IFNα உடன் 72 மணி நேரம் சிகிச்சை அளித்தோம்.Flo-1 செல்கள் pSTAT1 மற்றும் IRF1 இன் ஆரம்பத் தூண்டலைக் காட்டியது, சிகிச்சைக்குப் பிறகு 2 மணிநேரம் தொடங்கி 72 மணிநேரம் வரை தொடர்ந்தது, IRF1 இன் நிலையான அளவுகளில் நேரத்தைச் சார்ந்து குறைகிறது (படம் 1A).ISGகள் (MX1, IFITM1, OAS1/2, மற்றும் ISG15) 6 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு வலுவாகத் தூண்டப்படுவது கண்டறியப்பட்டது, IFNα (படம் 1A) க்கு கிளாசிக் மிட் மற்றும் லேட் ஃபேஸ் பதில்களைப் பிரதிபலிக்கிறது.இண்டர்ஃபெரான் பதில்களைப் படிக்க இந்த செல்லுலார் மாதிரியைப் பயன்படுத்தலாம் என்று இந்தத் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
IFNα சிகிச்சைக்குப் பிறகு Flo-1 கலங்களில் வேறுபட்ட புரத வெளிப்பாடு பதில்கள்.(A) 2, 6, 24, 48 மற்றும் 72 மணிநேரங்களுக்கு 10 ng/ml IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட Flo-1 கலங்களில் உள்ள புரத வெளிப்பாடு சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ISG ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோபிளாட் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.(B) குறிப்பிடப்பட்ட நேரங்கள் மற்றும் செறிவுகளுக்கு DSS உடன் குறுக்கு-இணைத்த பிறகு முழு செல் சாற்றின் Coomassie நீல நிற SDS-PAGE ஜெல்.(C) புரத குறுக்கு இணைப்பின் அளவை மதிப்பிடுவதற்கு அதே மாதிரிகளிலிருந்து p53(DO-1) ஆன்டிபாடி மூலம் பரிசோதிக்கப்பட்ட பிரதிநிதி இம்யூனோபிளாட்.
இன் சிட்டு புரத தொடர்பு நிலப்பரப்பைப் பிடிக்க, அதிக சவ்வு ஊடுருவல் மற்றும் ஒப்பீட்டளவில் குறுகிய எதிர்வினை நேரத்தின் காரணமாக பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் குறுக்கு-இணைப்பு முகவரான DSS ஐப் பயன்படுத்தினோம்.குறுகிய எதிர்வினை நேரம் குறுக்கு இணைப்பு புரதங்களின் பெரிய திரட்டுகள் உருவாவதைத் தடுக்க உதவுகிறது, இதன் மூலம் குறுக்கு இணைப்பின் நிலைத்தன்மையை பராமரிக்கிறது.உகந்த DSS செறிவைத் தீர்மானிப்பதற்கும், மிகை-குறுக்கு இணைப்புகளைத் தவிர்ப்பதற்கும், முதலில் 5, 2.5, மற்றும் 1 mM DSS க்கு முறையே 5, 10, 5 மற்றும் 30 நிமிடங்களுக்கு செல்களை வெளிப்படுத்தினோம், மேலும் Coomassie-stained SDS-PAGE மூலம் லைசேட்களை பகுப்பாய்வு செய்தோம். (தரவு காட்டப்படவில்லை) .செல் லைசேட்டுகள் மிகக் குறைந்த செறிவு மற்றும் குறுகிய நேரப் புள்ளியில் மிகவும் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்டதாகத் தோன்றுகிறது.எனவே, டிஎஸ்எஸ் 5 நிமிடங்களில் 1, 0.5 மற்றும் 0.1 எம்எம் என பெயரிடப்பட்டது (படம் 1 பி).5 நிமிடங்களுக்கு 0.5 mM DSS உடன் உகந்த குறுக்கு இணைப்பு காணப்பட்டது, மேலும் IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கலங்களுக்கு இந்த நிலைமைகள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன.கூடுதலாக, புரத குறுக்கு-இணைப்பின் அளவை மதிப்பிடுவதற்கு p53 (DO-1) ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி செய்யப்படும் வெஸ்டர்ன் பிளட்டை படம் 1C காட்டுகிறது.
க்ராஸ்லிங்கரைச் சேர்ப்பதற்கு முன் Flo-1 செல்கள் 24 மணிநேரத்திற்கு 10 ng/ml IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன.குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட செல்கள் இரண்டு-படி புரோட்டியோலிசிஸ் மூலம் லைஸ் செய்யப்பட்டன மற்றும் புரதங்கள் FASP ஆல் செயலாக்கப்பட்டன (படம். 2)24,25.குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன (படம் 2).MS/MS ஸ்பெக்ட்ரா பின்னர் புரத வரிசையுடன் பொருத்தப்பட்டு MaxQuant26,27 உடன் அளவிடப்படுகிறது.சிம்-எக்ஸ்எல் நிரலைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட ஸ்பெக்ட்ராவிலிருந்து குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் அடையாளம் காணப்பட்டன, மேலும் தனிப்பட்ட கலவைகள் xQuest28 மற்றும் SIM-XL29 திறந்த மூல கணினி மென்பொருள் பைப்லைன்களைப் பயன்படுத்தி சிக்கலான நெட்வொர்க்காக இணைக்கப்பட்டன (படம் 2).சிம்-எக்ஸ்எல் எளிய அல்லது சிக்கலான புரதக் கலவைகளில் புரதம்-புரத தொடர்புகள், உள் சங்கிலிகள் மற்றும் தனிப்பட்ட சங்கிலிகளை அடையாளம் காட்டுகிறது மற்றும் புரத கட்டமைப்புகளில் இடைவினைகளை காட்சிப்படுத்துவதற்கான ஸ்கிரிப்ட்களை வழங்குகிறது.கூடுதலாக, இது MS/MS29 ஸ்பெக்ட்ரம் தரத்தின்படி ஒவ்வொரு குறுக்குக் குறிப்பையும் ஐடி ஸ்கோராக தரவரிசைப்படுத்துகிறது.பல மிகவும் நம்பகமான புரத-புரத தொடர்புகள் மற்றும் வளாகங்கள் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, மேலும் மூலக்கூறு இயக்கவியல் (MD) மாடலிங் (படம் 2) 30, 31 ஐப் பயன்படுத்தி இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் மற்றும் வளாகங்களின் இணக்க மாற்றங்களைப் பயன்படுத்தி ஒரு புதிய தொடர்புகள் மேலும் ஆராயப்பட்டன.
CLMS முறையின் திட்ட மேலோட்டம்.ஃப்ளோ-1 செல்கள் 10 ng/ml IFNα உடன் 24 மணிநேரம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து DSS ஐப் பயன்படுத்தி சிட்டு புரோட்டீன் குறுக்கு-இணைப்பில் செல் லிசிஸ் மற்றும் ட்ரிப்சினைசேஷன் மூலம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது.ஆர்பிட்ராப் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட மாதிரிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன, மேலும் LC-MS/MS இன் போது பெப்டைட் முன்னோடிகளின் துண்டு துண்டிற்காக மேலும் மாதிரிகள் எடுக்கப்பட்டன.Crosslinked Peptides (SIM-XL) நிரலின் ஸ்பெக்ட்ரம் அங்கீகார இயந்திரத்தைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட ஸ்பெக்ட்ராவிலிருந்து இரண்டு இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் அடையாளம் காணப்பட்டன, மேலும் அனைத்து கலவைகளும் கணக்கீட்டு குழாய்களைப் பயன்படுத்தி சிக்கலான நெட்வொர்க்காக இணைக்கப்பட்டன.தவறான நேர்மறை விகிதம் (FDR) மதிப்பெண்களின் அடிப்படையில் குறைந்த நம்பிக்கை தொடர்புகளை வடிகட்டவும்.கோ-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷனைப் பயன்படுத்தி பல புதிய உயர்-நம்பிக்கை புரத-புரத தொடர்புகள் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன, மேலும் மூலக்கூறு இயக்கவியல் (MD) மாடலிங்கைப் பயன்படுத்தி வளாகங்களில் உள்ள இணக்க மாற்றங்கள் ஆராயப்பட்டன.
முறையே தூண்டப்படாத மற்றும் தூண்டப்பட்ட IFNα மாதிரிகளில் MaxQuant ஐப் பயன்படுத்தி மொத்தம் ~30,500 மற்றும் ~28,500 பெப்டைடுகள் கண்டறியப்பட்டன (துணை அட்டவணை S1, படம். 3A).இரண்டு நிகழ்வுகளிலும் பெப்டைட் நீள விநியோகம் பெரிய பெப்டைட்களின் அதிக விகிதத்தைக் காட்டியது, இது குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைட்கள் (படம் 3 பி, சி) இருப்பதைக் குறிக்கிறது.கூடுதலாக, IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் (படம் 3C) 40-55 வரம்பில் பெரிய பெப்டைட்களின் பெரிய விகிதம் இருந்தது.MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 மற்றும் HLA-F (படம் 3D) உள்ளிட்ட சிகிச்சை அளிக்கப்படாத மாதிரிகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​log2 தீவிரத்திற்கு எதிரான புரோட்டீன் மேப்பிங், கிளாசிக் இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டப்பட்ட புரதங்கள் அதிக அளவில் இருப்பதாகக் காட்டியது.ரியாக்டோம் பாத்வே தரவுத்தளத்தைப் பயன்படுத்தி IFNα சிகிச்சைக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் மூன்று மடங்குக்கு மேல் செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்களுக்கான பாதைகளின் பகுப்பாய்வு MHC-I-மத்தியஸ்த ஆன்டிஜென் விளக்கக்காட்சி மற்றும் செயலாக்கம் மிகவும் மேலாதிக்க பாதை என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 3E).முந்தைய அறிக்கைகளுக்கு இணங்க, OAS மற்றும் ISG15 மற்றும் IFNα/β மற்றும் சைட்டோகைன் சமிக்ஞை ஆகியவற்றால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட ஆன்டிவைரல் பதில்கள் செயல்படுத்தப்பட்ட பாதைகளில் அடங்கும்.கூடுதலாக, SIM-XL ஐப் பயன்படுத்தி முதலில் பெறப்பட்ட MS/MS ஸ்பெக்ட்ராவிலிருந்து லைசின் மற்றும் செரின்-குறிப்பிட்ட புரத குறுக்கு இணைப்புகள் அடையாளம் காணப்பட்டன.5 செல் வகைகளில் தனிப்பட்ட ISG மிகைப்படுத்தல் ஆய்வுகளின் மெட்டா பகுப்பாய்வு மூலம் 9 வைரஸ் வகுப்புகளிலிருந்து 104 ISGகள் 20 வைரஸ்கள் பரவியிருப்பதாக சமீபத்திய ஆய்வில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது9.எவ்வாறாயினும், பெரிய தரவுத்தொகுப்புகளைத் திரையிடுவதற்கான கணக்கீட்டு வரம்புகளைக் கடக்க, படாரியா மற்றும் பலர் அறிக்கை செய்த IRDS மரபணுக்களின் பட்டியலுக்கு இடையில் சாத்தியமான தொடர்புகளை ஆராய சிறிய தரவுத்தொகுப்புடன் தொடங்கினோம், அவற்றில் பெரும்பாலானவை ISGகள்.
IFNα (MaxQuant இலிருந்து பெறப்பட்ட தரவு) க்கு பதிலளிக்கும் வகையில் வேறுபட்ட வெளிப்படுத்தப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட புரதங்களின் அடையாளம்.(A) IFNα14 சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்படாத Flo-1 மாதிரிகளில் அடையாளம் காணப்பட்ட பொதுவான மற்றும் பிரத்தியேகமான பெப்டைட்களின் எண்ணிக்கையைக் குறிக்கும் வென் வரைபடம்.சிகிச்சையளிக்கப்படாத (B) மற்றும் IFNα சிகிச்சை (C) குறுக்கு இணைப்பு மாதிரிகளின் பெப்டைட் நீளம் விநியோகம்.(D) சிகிச்சை அளிக்கப்படாத மற்றும் IFNα14 சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட Flo-1 கலங்களுக்கு இடையே log2 (LFQ தீவிரம்) குறிக்கும் வெப்ப வரைபடம்.இடது குழு IFNα முன்னிலையில் மிகவும் சுறுசுறுப்பாக செயல்படும் புரதங்களைக் காட்டுகிறது.(இ) IFNα சிகிச்சைக்குப் பிறகு 20 முக்கிய செறிவூட்டல் பாதைகளைக் குறிக்கும் ஹிஸ்டோகிராம்.ரியாக்டோம் பாத்வே தரவுத்தளமானது, ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட IFNα-பதிலளிக்கக்கூடிய புரதங்களில் நான்கு மடங்குக்கும் அதிகமான மாற்றங்களை பகுப்பாய்வு செய்தது.
இண்டர்ஃபெரான்-மத்தியஸ்த ISG தூண்டுதல் நன்கு ஆவணப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, ஆனால் மூலக்கூறு மட்டத்தில் இந்த புரதங்கள் எவ்வாறு பரந்த அளவிலான உயிரியல் செயல்பாடுகளில் உச்சத்தை அடைகின்றன என்பது சரியாக புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.அறியப்பட்ட ISG களுக்கு இடையே அதிக நம்பிக்கையுடன் புரத தொடர்புகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.சுவாரஸ்யமாக, MX1, USP18, ROBO1, OAS3 மற்றும் STAT1 புரதங்கள் உள்ளிட்ட நெட்வொர்க்கை நாங்கள் அடையாளம் கண்டுள்ளோம், அவை IFNα சிகிச்சைக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் ஒரு பெரிய வளாகத்தை உருவாக்குகின்றன (படம் 4, அட்டவணை S2) 32,33,34.மிக முக்கியமாக, இந்த இடைவினைகள் IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட அனைத்து மும்மடங்குகளிலும் காணப்பட்டன, மேலும் அவை சிகிச்சையளிக்கப்படாத மாதிரிகளில் காணப்படவில்லை, அவை குறிப்பாக IFNα சிகிச்சையின் பிரதிபலிப்பாக உருவாக்கப்பட்டதாகக் கூறுகின்றன.இந்த ISG களின் வெளிப்பாட்டை STAT1 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனலாக ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பது அறியப்படுகிறது, ஆனால் புரத அளவில் ISG களுடன் அதன் தொடர்பு ஆய்வு செய்யப்படவில்லை.STAT1 இன் படிக அமைப்பு அதன் ஹெலிகல் டொமைன் (CCD) டைமர்ஸ் உருவாக்கத்தின் போது டிஎன்ஏ அல்லது புரோட்டோமர்களுடன் தொடர்பு கொள்ளவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது.இந்த α-ஹெலிஸ்கள் ஒரு ஹெலிகல் ஹெலிக்ஸ் கட்டமைப்பை உருவாக்குகின்றன, இது இடைவினைகள் ஏற்படுவதற்கு முக்கியமாக ஹைட்ரோஃபிலிக் மேற்பரப்பு பகுதியை வழங்குகிறது 35 .எங்கள் CLMS தரவுகளில், STAT1 உடனான பெரும்பாலான தொடர்புகள் CCD, இணைப்பான் டொமைன் அல்லது C-டெர்மினல் டெயில் (எச்சங்கள் 700-708) (படம் 4A) க்கு முந்தைய SH2 டொமைனில் நிகழ்ந்ததைக் கண்டோம்.USP18 ஆனது STAT2 இன் CCD மற்றும் DNA-பைண்டிங் டொமைனுடன் (DBD) பிணைக்கிறது மற்றும் வகை I இன்டர்ஃபெரான் சிக்னலிங் 24 ஐத் தடுப்பதற்காக வகை I இன்டர்ஃபெரான் ஏற்பி IFNAR2 இன் துணைக்குழுவிற்கு ஆட்சேர்ப்பு செய்யப்படுகிறது என்று முந்தைய ஆய்வில் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது.USP18 வினையூக்கி டொமைன் STAT1 DBD (படம் 4A,D) உடன் தொடர்பு கொள்கிறது என்பதையும் எங்கள் தரவு காட்டுகிறது, USP18 ஐ IFNAR2 க்கு ஈர்ப்பதில் STAT1 மற்றும் STAT2 இரண்டும் பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்று பரிந்துரைக்கிறது.
IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட கலங்களில் புரத-புரத ISG நெட்வொர்க் அடையாளம் காணப்பட்டது.(A) புரோட்டீன்-புரத தொடர்புகளைக் காட்டும் 2D இன்டராக்ஷன் ப்ளாட் (SIM-XL திட்டத்தில் உருவாக்கப்பட்டது), கோடுகள் இடைக்கணிப்பு இடைவினைகளைக் குறிக்கும் (கிராஸ்லிங்க் கட்ஆஃப் 3.5 என அமைக்கப்பட்டுள்ளது).வெவ்வேறு அடையாளங்களின் களங்கள் அவற்றின் நிறத்தால் குறிக்கப்படுகின்றன32: MX1 டொமைன், டைனமின்_என் (73–249), டைனமின்_எம் (259–547), மற்றும் ஜிஇடி (569–660).OAS3 டொமைன்கள்: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), மற்றும் OAS1_C (903-108).டொமைன் ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) மற்றும் fn3 (777–864).STAT1 புலங்கள்: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), மற்றும் STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட புரதங்களின் வட்ட பார்வையாளர் (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 மற்றும் STAT1) முறையே நீலம் மற்றும் சிவப்பு நிறங்களில் பெயரிடப்பட்ட இடைவினைகள் மற்றும் இடைவினைகள்.குறுக்கு இணைப்பு வாசல் 3.5 ஆக அமைக்கப்பட்டது.டாட் ப்ளாட்கள் MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), மற்றும் OAS3 (F) உடன் STAT1 தொடர்புத் தளங்களையும், இரண்டு பெப்டைடுகளுக்கு இடையேயான K அல்லது S தொடர்புத் தளங்களையும் குறிக்கின்றன.படத்தில், குறுக்கு இணைப்பு மதிப்பெண் வரம்பு 3.0 ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.(ஜி) STAT1 மற்றும் OAS3 DI டொமைன்களுக்கு இடையேயான பல்வேறு தொடர்புத் தளங்கள் PyMol (PyMOL மூலக்கூறு வரைகலை அமைப்பு, பதிப்பு 2.0 ஷ்ரோடிங்கர், எல்எல்சி.) அவற்றின் புரதக் கட்டமைப்புகளில் மிகைப்படுத்தப்பட்டுள்ளன;STAT1 (pdb id: 1bf533) மற்றும் OAS3 (pdb id: 4s3n34).) நிரல்.
USP18 இன் இரண்டு ஐசோஃபார்ம்கள் மனிதர்களில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன, இது முக்கியமாக கருவில் அமைந்துள்ள ஒரு முழு நீள புரதம் மற்றும் N-டெர்மினல் டொமைன் இல்லாத ஒரு ஐசோஃபார்ம், USP18-sf, இது சைட்டோபிளாசம் மற்றும் நியூக்ளியஸ் 36 இல் சமமாக விநியோகிக்கப்படுகிறது.கூடுதலாக, N-டெர்மினஸ் கட்டமைக்கப்படாததாகக் கணிக்கப்பட்டது மற்றும் ஐசோபெப்டிடேஸ் செயல்பாடு அல்லது ISG1537 பிணைப்பு தேவையில்லை.எங்கள் ஆய்வில் அடையாளம் காணப்பட்ட பெரும்பாலான இடைவினைகள் புரதத்தின் என்-டெர்மினஸில் அமைந்துள்ளன, இந்த இடைவினைகள் முழு-நீள USP18 (படம் 4A,D) ஐ உள்ளடக்கியதாகக் கூறுகிறது, இதனால் கருவில் நிகழலாம்.மேலும், என்-டெர்மினஸ் புரோட்டீன்-டு-புரோட்டின் இடைவினைகளுக்கு சிறப்பு வாய்ந்தது என்பதையும் எங்கள் தரவு குறிப்பிடுகிறது.IFNAR2 பிணைப்பு தளம் எச்சங்கள் 312-368 இடையே அமைந்துள்ளது, மேலும், சிக்கலான புரதங்கள் எதுவும் இந்த பகுதியுடன் பிணைக்கப்படவில்லை (படம். 4A) 37,38 .ஒன்றாக எடுக்கப்பட்ட இந்தத் தரவுகள், IFNAR2 பிணைப்பு டொமைன் ஏற்பி புரதத்தால் பிரத்தியேகமாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.கூடுதலாக, OAS3 மற்றும் ROBO1 மட்டுமே N-டெர்மினஸ் மற்றும் IFNAR2 பிணைப்பு தளத்தின் (படம் 4A) அப்ஸ்ட்ரீம் டொமைன்களுடன் தொடர்புடையதாகக் கண்டறியப்பட்டது.
ROBO1 என்பது டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் சிக்னலிங் மூலக்கூறுகளின் இம்யூனோகுளோபுலின் (Ig) சூப்பர் குடும்பத்தைச் சேர்ந்தது மற்றும் எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் பகுதியில் ஐந்து Ig டொமைன்கள் மற்றும் மூன்று ஃபைப்ரோனெக்டின் (Fn) டொமைன்களைக் கொண்டுள்ளது.இந்த எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் டொமைன்கள் ஒரு சவ்வு-அருகிலுள்ள பகுதி மற்றும் ஒற்றை டிரான்ஸ்மேம்பிரேன் ஹெலிக்ஸ் 39 ஆகியவற்றால் பின்பற்றப்படுகின்றன. ஒரு கட்டமைக்கப்படாத உள்செல்லுலார் பகுதி சி-டெர்மினஸில் அமைந்துள்ளது மற்றும் செயல்திறன் புரத பிணைப்பை மத்தியஸ்தம் செய்யும் பாதுகாக்கப்பட்ட வரிசை மையக்கருத்துக்களைக் கொண்டுள்ளது.அமினோ அமிலங்கள் ~1100 முதல் 1600 வரை விரிவடையும் பகுதி பெரும்பாலும் ஒழுங்கற்றது.MX1 ROBO1 உடன் Ig, Fn மற்றும் உள்செல்லுலார் டொமைன்கள் மூலம் தொடர்புகொள்வதைக் கண்டறிந்தோம், அதே நேரத்தில் STAT1 உடனான பெரும்பாலான இடைவினைகள் அதன் CCD, இணைப்பான் டொமைன் மற்றும் ROBO1 இன் C-டெர்மினஸ் (படம் 4A,E) ஆகியவற்றுக்கு இடையே நிகழ்கின்றன.மறுபுறம், DI, DIII மற்றும் OAS3 இணைப்பான் பகுதிகளுடனான தொடர்புகள் ROBO1 புரதம் முழுவதும் விநியோகிக்கப்பட்டன (படம் 4A).
ஒலிகோடெனிலேட் சின்தேஸ் (OAS) புரதக் குடும்பம் உள்செல்லுலார் டபுள்-ஸ்ட்ராண்ட்டட் ஆர்என்ஏ (டிஎஸ்ஆர்என்ஏ)வை ஏற்றுக்கொண்டு பிணைக்கிறது, இணக்கமான மாற்றங்களுக்கு உள்ளாகிறது, மேலும் 2′,5′-இணைக்கப்பட்ட ஒலிகோடெனிலேட்டுகளை (2-5 அஸ்) 40 ஒருங்கிணைக்கிறது.மூன்று OAS களில், OAS3 ஆனது dsRNA க்கு மிக உயர்ந்த தொடர்பை வெளிப்படுத்துகிறது மற்றும் RNase L ஐ செயல்படுத்தும் மற்றும் அதன் மூலம் வைரஸ் பிரதிபலிப்பு 41 ஐ கட்டுப்படுத்தும் குறைந்தபட்ச அளவு 2-5 As ஐ ஒருங்கிணைக்கிறது.OAS குடும்பம் பாலிமரேஸ் பீட்டா (pol-β) போன்ற நியூக்ளியோடைடு பரிமாற்ற களங்களைக் கொண்டுள்ளது.சி-டெர்மினல் டொமைனின் (டிஐஐ) வினையூக்கச் செயல்பாடு, ஓஏஎஸ்342 செயல்படுத்துவதற்குத் தேவைப்படும் டிஎஸ்ஆர்என்ஏ-பைண்டிங் டொமைனை (டிஐ) சார்ந்தது என்பதை முந்தைய ஆராய்ச்சி காட்டுகிறது.OAS3 இன் DI மற்றும் DII டொமைன்கள் CCD மற்றும் SH2 மற்றும் STAT1 TAD (படம் 4A,F) இடையே ஒரு சிறிய சந்திப்பு பகுதியுடன் தொடர்புகொள்வதை நாங்கள் கவனித்தோம்.புரோட்டீன் கட்டமைப்பில் வெவ்வேறு குறுக்கு இணைப்பு தளங்களை மேலெழுதுவது, β-தாள் மற்றும் DBD STAT1 லூப் மற்றும் OAS3 இன் DI டொமைனில் (படம் 4G) 60-75 எச்சங்களால் உருவாக்கப்பட்ட திறந்த பாக்கெட் அல்லது குழி ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு வெளிப்படுத்தப்பட்டது.வளாகத்தில் உள்ள புரதங்களின் நோக்குநிலையானது OAS3 உடனான தொடர்புகள் எதுவும் அதன் DI டொமைனின் (Fig. S1A) டிஎன்ஏ-பிணைப்புத் திறனில் குறுக்கிடவில்லை என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகிறது.கூடுதலாக, GTPase MX1 இன் N-டெர்மினல் டொமைன் OAS3 (படம் 4A) இன் DI மற்றும் DIII டொமைன்களுடன் விரிவாக தொடர்பு கொள்கிறது.மூன்று IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மறுநிகழ்வுகளிலும் OAS1 மற்றும் MX1 ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான ஒரு தொடர்பை நாங்கள் கவனித்தோம், அங்கு ஒரு OAS1 டொமைன் (வினையூக்கமாக செயலில் உள்ளது) மூன்று MX1 டொமைன்களுடனும் (படம் S2A,B) தொடர்பு கொண்டது.
MX புரதங்கள், dynein போன்ற GTPases இன் பெரிய குடும்பத்தின் ஒரு பகுதியாகும் )டொமைன் எஃபெக்டர் டொமைன்25,43.MX1 வைரஸ் மரபணுவின் படியெடுத்தலைத் தடுக்க வைரஸ் பாலிமரேஸின் துணைக்குழுக்களுடன் பிணைக்கிறது43.முன்னர் அறிவிக்கப்பட்ட ஈஸ்ட் டூ-ஹைப்ரிட் திரையானது PIAS1-தொடர்புடைய MX1 டிஎன்ஏ-பிணைப்பு செயல்பாட்டைத் தடுப்பதன் மூலம் STAT1-மத்தியஸ்த மரபணு செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது மற்றும் SUMO E344,45 லிகேஸ் செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது.இங்கே, MX1 STAT1 (படம் 4C,D) உடன் பிணைக்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம், இருப்பினும் IFNα க்கு பதிலளிக்கும் வகையில் இந்த தொடர்பு STAT1-மத்தியஸ்த மரபணு செயல்பாட்டை எவ்வாறு பாதிக்கிறது என்பதை மேலும் ஆய்வு செய்ய வேண்டும்.கூடுதலாக, MX1 IFIT3 மற்றும் DDX60 உடன் மூன்று IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மறுநிகழ்வுகளிலும் (படம். S2C) தொடர்புகொண்டதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம்.
DDX60 என்பது IFN-தூண்டப்பட்ட சைட்டோபிளாஸ்மிக் ஹெலிகேஸ் ஆகும், இது வைரஸ் RNA46 இன் RIG-I-சுயாதீனமான சீரழிவில் பங்கு வகிப்பதாக முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டது.இது RIG-I உடன் தொடர்பு கொள்கிறது மற்றும் அதன் சிக்னலை ஒரு லிகண்ட்-குறிப்பிட்ட முறையில் செயல்படுத்துகிறது.MX1 மற்றும் IFIT3 உடனான அதன் பெரும்பாலான இடைவினைகள் நீண்ட N- மற்றும் C- முனையப் பகுதிகளுக்குள் நியமன டொமைன்கள் அல்லது மையக்கருத்துகள் இல்லாமல் நிகழ்கின்றன (படம். S2E,F).இருப்பினும், MX1 DEXD/H-Box ஹெலிகேஸ் டொமைனுடன் தொடர்புடையது (படம். S2E).IFIT குடும்பத்தின் புரதங்கள் டெட்ராபெப்டைட் ரிபீட் (TPR) எனப்படும் தனித்துவமான ஹெலிக்ஸ்-டர்ன்-ஹெலிக்ஸ் மையக்கருத்தின் டேன்டெம் நகல்களைக் கொண்டுள்ளன.IFIT3 RIG-I சமிக்ஞையின் நேர்மறையான மாடுலேட்டராகக் கண்டறியப்பட்டது, எனவே MAVS வளாகத்தின் ஒரு அங்கமாகும்.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், IFIT3 மற்றும் DDX60 முதன்மையாக IFIT3 இன் TPR 3-6 க்கு இடைப்பட்ட பகுதியில் தொடர்புகொள்வதாகவும் RIG-I/MAVS சிக்னலில் (படம். S2F) பங்கு வகிக்கக்கூடும் என்றும் எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது.
முழு புரோட்டீமையும் திரையிடுவது கணக்கீட்டு ரீதியாக தீவிரமானது என்பதால், IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மறுநிகழ்வுகளில் ஒன்றின் இருப்புக்காக முழு மனித யூனிப்ரோட் தரவுத்தளத்தையும் திரையிட்டோம்.இந்தப் பிரதியில், எச்எல்ஏ-ஏ-க்கான மிகவும் நம்பகமான பல தொடர்பு நெட்வொர்க்குகளைக் கண்டறிந்தோம்.MS/MS ஸ்பெக்ட்ராவால் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதப் பாதைகளின் பகுப்பாய்வு MHC-I-அடிப்படையிலான ஆன்டிஜென் செயலாக்கம் மற்றும் விளக்கக்காட்சியானது இன்டர்ஃபெரான் (படம். 3D) மூலம் தூண்டப்பட்ட முக்கிய பாதையாகும் என்பதைக் காட்டுகிறது.எனவே, அனைத்து குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட மாதிரிகளிலும் அதிக நம்பிக்கையுடன் MHC-I மூலக்கூறுகளின் புரத தொடர்புகளைப் படிப்பதில் கவனம் செலுத்தினோம்.HLA ஆனது α1, α2 மற்றும் α3 களங்கள் மற்றும் ஒளிச் சங்கிலிகளைக் கொண்டுள்ளது, மேலும் மைக்ரோகுளோபுலின் β2 (β2m) என்பது ஒரு நிலையான சாப்பரோன் புரதமாகும்.எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தில் கூடியதும், பெப்டைட் லிகண்ட்ஸ் இல்லாத நிலையில் HLA நிலையற்றது50.பெப்டைட்-பிணைப்பு பள்ளம் பெப்டைட் அல்லாத வடிவத்தில் அதிக பாலிமார்பிக் மற்றும் கட்டமைக்கப்படாத α1 மற்றும் α2 டொமைன்கள் மற்றும் ஒப்பீட்டளவில் குறைவான பாலிமார்பிக் α351 டொமைன் ஆகியவற்றால் உருவாக்கப்படுகிறது.IFNα முன்னிலையில், நாங்கள் இரண்டு HLA-A வளாகங்களைக் கண்டறிந்தோம்: ஒன்று HMGA1 மற்றும் H2B உடன் தொடர்பு கொள்கிறது (படம் 5, அட்டவணை S3) மற்றொன்று MDN1, LRCH4 மற்றும் H2B (படம் 6).
IFNα H2B (H2BFS) மற்றும் HMGA1 உடன் HLA-A தொடர்பு நெட்வொர்க்கைத் தூண்டுகிறது.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 வளாகத்தில் உள்ள பல்வேறு வகையான தொடர்புகளை சித்தரிக்கும் 2D ப்ளாட் (SIM-XL மென்பொருளில் உருவாக்கப்பட்டுள்ளது): இன்டர்லிங்க் (நீலம்), இன்டர்லிங்க் (சிவப்பு) மற்றும் ஒற்றை இணைப்பு (கருப்பு)..வெவ்வேறு அடையாளங்களின் களங்கள் வண்ணக் குறியிடப்பட்டவை32: H2B (ஹிஸ்டோன்; 2–102) மற்றும் MHC-I (MHC_1; 25–203, குழு C1; 210–290 மற்றும் MHC_I_C; 337–364).குறுக்கு இணைப்பு வாசல் 3.5 ஆக அமைக்கப்பட்டது.புள்ளி அடுக்குகள் H2B (B) மற்றும் HMGA1 (C) உடனான HLA-A தொடர்புத் தளங்களையும், இரண்டு பெப்டைடுகளுக்கு இடையேயான K அல்லது S தொடர்புத் தளங்களையும் குறிக்கின்றன.படத்தில், குறுக்கு இணைப்பு மதிப்பெண் வரம்பு 3.0 ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.(D) PyMOL திட்டத்தில் H2B, HLA-A மற்றும் HMGA1 புரதங்களின் கட்டமைப்புகளில் காட்டப்படும் புரதங்களுக்கிடையேயான உறவுகள்.இந்த கட்டமைப்புகள் Phyre2 சேவையகத்தைப் (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டது மற்றும் H2B, HLA-A மற்றும் HMGA1 புரதங்களுக்கான டெம்ப்ளேட் கட்டமைப்புகள் முறையே 1kx552, 1kj349 மற்றும் 2eze55 ஆகும்.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 மற்றும் LRCH4 உடன் HLA-A தொடர்பு நெட்வொர்க்கைத் தூண்டுகிறது.(A) 2D ஊடாடும் வரைபடத்தில் (SIM-XL மென்பொருளில் உருவாக்கப்பட்டுள்ளது) MDN1 வட்டமாகக் குறிப்பிடப்பட்ட உள்மூலக்கூறு (சிவப்பு) மற்றும் இடைக்கணிப்பு (நீலம்) குறுக்கு இணைப்புகள்.குறுக்கு இணைப்பு வாசல் 3.5 ஆக அமைக்கப்பட்டது.வெவ்வேறு அடையாளங்களின் களங்கள் வண்ணக் குறியிடப்பட்டவை32: H2B (ஹிஸ்டோன்; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, குழு C1; 210–290 மற்றும் MHC_I_C; 337–364) மற்றும் LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) மற்றும் CH (535–641)).(B) PyMOL திட்டத்தில் H2B, HLA-A, LRCH4 மற்றும் MDN1 புரதங்களின் கட்டமைப்புகளில் காட்டப்படும் புரதங்களுக்கிடையேயான உறவுகள்.H2B, HLA-A, LRCH4 மற்றும் MDN1 புரதங்களுக்கு 1kx552, 1kj349, 6hlu62 மற்றும் 6i2665 ஆகிய டெம்ப்ளேட் கட்டமைப்புகளுடன் Phyre2 சேவையகத்தைப் (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) பயன்படுத்தி இந்த கட்டமைப்புகள் வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. முறையே.H2B (C), LRCH4 (D) மற்றும் MDN1 (E) உடன் HLA-A க்கான K அல்லது S தொடர்புத் தளங்களைக் காட்டும் புள்ளிகள்.அடுக்குகளுக்கு, குறுக்கு இணைப்பு மதிப்பெண் வரம்பு 3.0 ஆக அமைக்கப்பட்டது.
மரபணுவின் ஒருமைப்பாட்டை பராமரிப்பதுடன், ஹிஸ்டோன் H2B டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை ஒழுங்குபடுத்துவதில் ஈடுபட்டுள்ளது.H2B புரதமானது மைய ஹிஸ்டோன் டொமைனை (HFD) மூன்று α-ஹெலிஸால் பிரிக்கப்பட்ட லூப்கள் மற்றும் ஒரு C-டெர்மினல் டெயில் 41,52 மூலம் உருவாக்குகிறது.H2B உடனான பெரும்பாலான தொடர்புகள் α1 ஹெலிக்ஸில் நிகழ்கின்றன, இது HFD ஹெட்டோரோடைமருடன் (படம் 5A,B) ட்ரைமரைசேஷனை வழங்குகிறது.டிஎன்ஏ பிணைப்பில் லைசின்கள் ஈடுபட்டிருந்தாலும், சில லைசின்கள் மாற்று அசிடைலேஷன் அல்லது மெத்திலேஷன் தளங்களாகவும் உள்ளன.எடுத்துக்காட்டாக, H2B இலிருந்து K43, K46 மற்றும் K57 எச்சங்கள் நேரடி DNA பிணைப்பில் ஈடுபடவில்லை, ஆனால் அவை பல்வேறு பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மாற்றங்களின் இலக்குகள்53.இதேபோல், H2B இல் உள்ள K44, K47 மற்றும் K57 எச்சங்கள் IFNα முன்னிலையில் மாற்றுப் பாத்திரத்தை வகிக்கலாம், இதில் மற்ற புரதங்களுடனான தொடர்புகளும் அடங்கும் (படம் 5A, B).கூடுதலாக, எக்ஸ்ட்ராக்ரோமோசோமால் ஹிஸ்டோன் H2B பல்வேறு உயிரணு வகைகளில் நோயெதிர்ப்பு மறுமொழியை செயல்படுத்துகிறது, தொற்று முகவர்கள் அல்லது சேதமடைந்த செல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ (டிஎஸ்டிஎன்ஏ) துண்டுகளைக் கண்டறிய சைட்டோசோலிக் சென்சாராக செயல்படுகிறது54.DNA வைரஸ்கள் முன்னிலையில், H2B குறைப்பு IFN-β உற்பத்தி மற்றும் STAT154 பாஸ்போரிலேஷனைத் தடுக்கிறது.மற்ற மைய ஹிஸ்டோன்களை விட H2B கருவின் உள்ளேயும் வெளியேயும் வேகமாக நகரும்.தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட சிகிச்சை அளிக்கப்படாத மாதிரிகளில் MDN1 மற்றும் LRCH4 உடனான H2B தொடர்புகளும் காணப்பட்டன.HLA-A ஆனது H2B உடன் மூன்று IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளிலும் மற்றும் ஒரு சிகிச்சை அளிக்கப்படாத மறு மாதிரியிலும் தொடர்புகொண்டதைக் கண்டறிந்தோம்.டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையிலிருந்து சுயாதீனமான மாற்று உடலியல் செயல்பாட்டில் H2B இன் பங்கை இந்தத் தரவு பிரதிபலிக்கிறது.
HMGA1 (உயர் இயக்கம் குழு AT-ஹூக் 1), நோயை ஊக்குவிக்கும் அமினோ அமிலங்கள் நிறைந்த ஒரு சிறிய நியூக்ளியோபுரோட்டீன், HLA-A உடன் இணைந்து அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது.இது ஒரு அமிலத்தன்மை கொண்ட சி-டெர்மினல் வால் மற்றும் AT கொக்கிகள் எனப்படும் மூன்று தனித்துவமான DBD களைக் கொண்டுள்ளது, ஏனெனில் அவை dsDNA55,56 இல் AT- நிறைந்த பகுதியின் சிறிய பள்ளத்துடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.இந்த பிணைப்பு டிஎன்ஏவை வளைக்க அல்லது நேராக்குகிறது, இதன் மூலம் நியமன டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் அதன் ஒருமித்த வரிசையை அணுக அனுமதிக்கிறது.சி-டெர்மினல் டெயில் புரோட்டீன்-புரத தொடர்புகள் மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் ஆட்சேர்ப்பு ஆகியவற்றில் ஈடுபட்டுள்ளதாக நம்பப்படுகிறது, ஏனெனில் சி-டெர்மினல் நீக்குதல் மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைத் தொடங்க முடியாது.மேலும், இந்த டொமைனில் பல பாதுகாக்கப்பட்ட பாஸ்போரிலேஷன் தளங்கள் உள்ளன, அவை கைனேஸ்கள் 58 க்கான அடி மூலக்கூறுகளாக அறியப்படுகின்றன.சி-டெர்மினல் டொமைனுக்கு வெளியே எச்எம்ஜிஏ1 உடனான எச்எல்ஏ-ஏ மற்றும் எச்2பி தொடர்புகளை நாங்கள் கவனித்தோம், சி-டெர்மினல் டொமைன் முக்கியமாக டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஃபேக்டர் பைண்டிங்கிற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது (படம். 5 ஏ, சி).HMGA புரதங்கள் அடாப்டர் DNA உடன் பிணைக்க ஹிஸ்டோன் H1 உடன் போட்டியிடுகின்றன, இதன் மூலம் அணுகல்தன்மையை அதிகரிக்கிறது.இதேபோல், HMGA ஹிஸ்டோன் H1 உடன் போட்டியாக டிஎன்ஏ இணைப்புடன் இணைந்து ஹிஸ்டோன் H2B உடன் தொடர்பு கொள்கிறது.HMGB1 டென்ட்ரிடிக் கலங்களில் HLA-A, -B மற்றும் -C இன் வெளிப்பாட்டைத் தூண்டுகிறது, இது அவற்றின் செயல்பாட்டிற்கு வழிவகுக்கிறது.HMGA1 ஆனது HLA-A இன் α1 மற்றும் α3 டொமைன்களுடன் அதன் 3 DBDக்கு வெளியே உள்ள பெரும்பாலான இடைவினைகளுடன் (படம் 5A,C) தொடர்புகொள்வதைக் கண்டறிந்தோம்.எங்கள் கைகளில், HLA-A கருவில் உள்ளமைக்கப்பட்டதாகக் கண்டறியப்பட்டது (தரவு காட்டப்படவில்லை), மேலும் H2B மற்றும் HMGA1 ஆகியவை கருவில் இருப்பதால், இந்த தொடர்பு கருவில் நிகழலாம்.H2B, HLA-A மற்றும் HMGA1 ஆகியவற்றுக்கு இடையே அளவிடப்படும் குறிப்பிட்ட சேர்க்கைகள் படம் 5D இல் காட்டப்பட்டுள்ளன.
மற்ற புரதங்களுடனான HLA-A இன் பெரும்பாலான இடைவினைகள் அதன் α1 மற்றும் α2 களங்கள் மற்றும் ஒழுங்கற்ற C-டெர்மினல் டொமைன் (படம் 6) ஆகியவற்றிற்குள் நிகழ்கின்றன.இந்த எடுத்துக்காட்டுகளில் ஒன்றில், LRCH4 (படம் 6A,D) இன் ஒழுங்கற்ற N-டெர்மினல் டெயிலுடன் HLA-A தொடர்புகொள்வதைக் கண்டறிந்தோம்.LRCH4 TLR4 செயல்படுத்தல் மற்றும் LPS சைட்டோகைன் தூண்டலை ஒழுங்குபடுத்துகிறது, இதன் மூலம் உள்ளார்ந்த நோயெதிர்ப்பு மறுமொழியை மாற்றியமைக்கிறது60,61.இது ஒன்பது லியூசின்-ரிச் ரிபீட்ஸ் (LRRs) மற்றும் அதன் எக்டோடோமைனில் ஒரு கால்மோடுலின் (CH) ஹோமோலஜி மோட்டிஃப் கொண்ட ஒரு சவ்வு புரதமாகும், அதைத் தொடர்ந்து ஒரு டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் டொமைன் (TMD) 60 , 62 .CH டொமைன்கள் புரதம்-புரத தொடர்புகளை மத்தியஸ்தம் செய்வதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது 60 .LRR மற்றும் CH டொமைன்களுக்கு இடையில் சுமார் 300 அமினோ அமிலங்களின் நீட்டிப்பு ஒப்பீட்டளவில் அணுகக்கூடியது ஆனால் ஒழுங்கற்றது.புரத-புரத நெட்வொர்க்குகள் மற்றும் வெசிகுலர் டிரான்ஸ்போர்ட் 63 ஆகியவற்றின் மத்தியஸ்தர்களாக ஒழுங்கற்ற பகுதிகளின் செயல்பாட்டின் அடிப்படையில், பெரும்பாலான புரத இடைவினைகள் ஒழுங்கற்ற பகுதிகளில் நிகழ்கின்றன என்பதைக் கண்டறிந்தோம்.MDN1 உடனான தொடர்புகள் LRR1, LRR6, CH டொமைன்கள் மற்றும் சீரற்ற பகுதிகள் உட்பட புரதத்தின் நீளம் முழுவதும் விநியோகிக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் H2B முக்கியமாக CH டொமைனுடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது (படம் 6A, B).குறிப்பிடத்தக்க வகையில், எந்தவொரு தொடர்புகளிலும் TMJ சேர்க்கப்படவில்லை, இது CLMS அணுகுமுறையின் தனித்துவத்தை பரிந்துரைக்கிறது (படம் 6A, B).
MDN1 ஆனது HLA-A புரத நெட்வொர்க்கின் ஒரு பகுதியாகவும் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது (படம் 6A).இது புரதங்களின் AAA குடும்பத்தைச் சேர்ந்தது (பல்வேறு செயல்பாடுகளுடன் தொடர்புடைய ATPases).இது அதே N-டெர்மினல் AAA டொமைன் ஆகும், இது ஹெக்ஸாமெரிக் வளையமாக ஒழுங்கமைக்கப்பட்டு 60S 64 ரைபோசோமால் சப்யூனிட்டில் இருந்து அசெம்பிளி காரணியை நீக்குகிறது.dynein64,65,66 ஐப் போலவே தோன்றுகிறது.கூடுதலாக, Asp/Glu நிறைந்த பகுதி MIDAS டொமைனால் (உலோக அயன் சார்ந்த தளம்) பின்பற்றப்படுகிறது.MDN1 இன் பெரிய அளவு (தோராயமாக 5600 அமினோ அமிலங்கள்) மற்றும் நன்கு ஆய்வு செய்யப்பட்ட புரதங்களுடன் அதன் வரையறுக்கப்பட்ட ஹோமோலஜி காரணமாக, மனிதர்களில் அதன் அமைப்பு மற்றும் செயல்பாடு பற்றி அதிகம் அறியப்படவில்லை.நாங்கள் HLA-A, H2B, மற்றும் LRCH4 ஆகியவற்றை MDN1 பிணைப்புக் கூட்டாளர்களாகக் கண்டறிந்தோம் மற்றும் PyMol (படம் 6A,B) இல் புரத வளாகங்களாக அவற்றின் நோக்குநிலையை வெளிப்படுத்தினோம்.இந்த மூன்று புரதங்களும் AAA டொமைன், டைனைன் போன்ற இணைப்பான் டொமைன் மற்றும் MIDAS MDN1 டொமைனுடன் தொடர்பு கொள்கின்றன.முந்தைய அறிக்கையில், தூண்டில் புரதங்களின் தொடர்பு சுத்திகரிப்பு MDN1 ஐ ஹிஸ்டோன் H2B67 உடன் தொடர்புடைய புரதமாக அடையாளம் கண்டுள்ளது.கூடுதலாக, ஒரு சமீபத்திய ஆய்வு HCT116 கலங்களில் MDN மற்றும் HLA-B இடையே தொடர்பு-சுத்திகரிக்கப்பட்ட மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி, எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளை ஆதரிக்கிறது.IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் இந்த வளாகத்தை அடையாளம் காண்பது, இன்டர்ஃபெரான் சிக்னலில் MDN1க்கான பங்கைக் குறிக்கிறது.
எச்.எல்.ஏ மரபணுக்கள் மிகவும் பாலிமார்பிக் என்பதால், ஃப்ளோ-1 கலங்களின் ஆர்.என்.ஏ வரிசைப்படுத்தல் தரவிலிருந்து எச்.எல்.ஏ-ஏ, -பி மற்றும் -சி மேப்பிங் ரீட்களை பிரித்தெடுத்தோம் (தரவு காட்டப்படவில்லை).HLA-A இல் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் அமைந்துள்ள பகுதிகளில் HLA-A, -B மற்றும் -C ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வரிசைமுறை வாசிப்புடன் ஒத்துப்போகும் பெப்டைட் வரிசைகள் வெளிப்படுத்தின (படம் S3).கூடுதலாக, H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 புரதங்களுடன் HLA-B/C மூலக்கூறுகளின் புரதம்-க்கு-புரதம் குறுக்கு-இணைப்பை நாங்கள் கவனிக்கவில்லை.HLA-A, MDN1, LRCH1 மற்றும் HMGA1 ஆகியவற்றுக்கு இடையே காணப்படும் புரத தொடர்பு HLA-A குறிப்பிட்டது என்று இது அறிவுறுத்துகிறது.கூடுதலாக, குறுக்கு இணைப்பு இல்லாத மாதிரிகளின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு (அட்டவணை S4) HLA-B அல்லது HLA-C உடன் ஒப்பிடும்போது HLA-A அதிக வரிசைக் கவரேஜைக் கொண்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது.HLA-A க்காக அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள் IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்படாத மாதிரிகள் இரண்டிலும் அதிக தீவிரத்தன்மை கொண்டவை.
இங்கு அடையாளம் காணப்பட்ட இடைவினைகள் இரண்டு புரதங்களின் குறுக்கு-இணைப்பு காரணமாக இல்லை என்பதை உறுதிப்படுத்த, இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் மதிப்பீடுகளைச் செய்வதன் மூலம் இரண்டு புதிய HLA-A ஊடாடும் காரணிகளை நாங்கள் மேலும் உறுதிப்படுத்தினோம்.எண்டோஜெனஸ் MDN1 மற்றும் H2B உடனான HLA-A இடைவினைகள் IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்படாத Flo-1 செல்கள் இரண்டிலும் கண்டறியப்பட்டது (படம் 7, படம் S4).இம்யூனோபிரெசிபிடேட்டுகளில் H2B ஆல் HLA-A கைப்பற்றப்பட்டது என்பதையும், சிகிச்சை அளிக்கப்படாத உயிரணுக்களின் இம்யூனோபிரெசிபிடேட் மாதிரிகளில் HLA-A இல்லாததால் IFNα சிகிச்சையின் காரணமாக இந்த தொடர்பு ஏற்பட்டது என்பதையும் நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம் (படம் 7A).எவ்வாறாயினும், H2B மற்றும் MDN1 உடன் HLA-A பிணைப்பை IFNα வித்தியாசமாக ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது.IFNα H2B மற்றும் HLA-A இடையே தொடர்பைத் தூண்டுகிறது, ஆனால் MDN1 உடனான அதன் தொடர்பைக் குறைக்கிறது.MDN1 கட்டுப்பாடுகளில் HLA-A உடன் தொடர்புடையதாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், மேலும் IFNα ஐச் சேர்ப்பது IFNα (படம் 7B,C) மூலம் MDN1 தூண்டலில் இருந்து சுயாதீனமாக இந்த தொடர்புகளைக் குறைத்தது.கூடுதலாக, HLA-A இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் A549 கலங்களில் H2B ஐ கைப்பற்றியது (படம். S4), இந்த தொடர்பு செல் வகையிலிருந்து சுயாதீனமானது என்று பரிந்துரைக்கிறது.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் H2B மற்றும் MDN1 உடன் HLA-A இன் இன்டர்ஃபெரான்-மத்தியஸ்த தொடர்புகளை ஆதரிக்கின்றன.
HLA-A ஆனது H2B மற்றும் MDN1ஐ இணை சுத்திகரிக்கும்.பிரதிநிதித்துவ எண்டோஜெனஸ் H2B (A) மற்றும் MDN1 (B) இம்யூனோபிளாட்டுகள் IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட Flo-1 செல்களிலிருந்து இம்யூனோபிரெசிபிட்டேட் செய்யப்பட்டு, சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுக்காக ஆய்வு செய்யப்பட்டன.சுட்டி மற்றும் முயல் IgG எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாக பயன்படுத்தப்பட்டது.(சி) வெவ்வேறு ஆன்டிஜென்களின் ஒப்பீட்டு அளவுகள் (உள்ளீடு) சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுக்கு எதிராக ஆய்வு செய்யப்பட்ட இம்யூனோபிளாட்களால் சித்தரிக்கப்படுகின்றன, β-ஆக்டின் ஏற்றுதல் கட்டுப்பாட்டாக பயன்படுத்தப்பட்டது.
இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டப்பட்ட மிகவும் நம்பகமான குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட நெட்வொர்க்குகளில் ஒன்றின் கட்டமைப்பு பண்புகள், H2B-HLA-A-HMGA1, ஆராயப்பட்டன.இந்த வளாகத்தில் ஈடுபட்டுள்ள புரதங்களின் இணக்க இயக்கவியலைப் புரிந்துகொள்ள மாற்று அணுகுமுறையாக மூலக்கூறு இயக்கவியல் மாடலிங்கைப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 8).CLMS தரவின் அனுமானங்கள் H2B, HLA-A மற்றும் HMGA1 புரதங்களின் வெவ்வேறு இணக்கங்களின் சாத்தியத்தைக் கூறுகின்றன.எனவே, பின்வரும் சாத்தியமான வளாகங்கள் ஒரு கரைப்பான் ஊடகத்தில் வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A மற்றும் H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி ஒரு ஆரம்ப புரத-புரத நறுக்குதல் திரை இந்த புரதங்களுக்கிடையில் வேறுபடக்கூடிய சாத்தியமான இணக்கங்களை பரிந்துரைத்தது (படம் 8A).நறுக்குதல் புரத வளாகத்தின் காட்சிப்படுத்தல் பல இடைவினைகள் மற்றும் சாத்தியமான இணக்கங்களை வெளிப்படுத்தியது (படம் 5A, 8).எனவே, ஒரு சாத்தியமான இணக்கம் படம் 8A இல் காட்டப்பட்டுள்ளது (குறுக்கு-இணைப்புகள் என்று பெயரிடப்பட்டது) மேலும் இது MD மாடலிங் பைப்லைனைப் பயன்படுத்தி மேலும் மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது.கூடுதலாக, H2B அல்லது HMGA1 ஐ HLA-A உடன் பிணைப்பது HLA-A (படம் 8A) க்கு H2B இன் அதிக தொடர்பை எடுத்துக்காட்டுகிறது.
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A மற்றும் H2B-HLA-A-HMGA1 வளாகங்களுக்கு இடையே சாத்தியமான நெட்வொர்க்குகளின் இணக்க இயக்கவியல்.(A) இடது பேனல் என்பது இன்ட்ராமாலிகுலர் (சிவப்பு) மற்றும் இன்டர்மாலிகுலர் (நீலம்) குறுக்கு இணைப்புகளின் 2D வரைபடம் (சிம்-எக்ஸ்எல் மென்பொருளில் உருவாக்கப்பட்டது) (கிராஸ்லிங்க் கட்ஆஃப் 3.5 என அமைக்கப்பட்டுள்ளது).கூடுதலாக, அடையாளம் காணப்பட்ட குறுக்கு-இணைப்பு எச்சங்கள் H2B, HLA-A மற்றும் HMGA1 புரதங்களின் கட்டமைப்புகளில் பெயரிடப்பட்டுள்ளன.இந்த புரதங்களின் தொடர்புடைய இணக்கங்கள் MOE தொகுப்பில் செயல்படுத்தப்பட்ட நறுக்குதல் பைப்லைனைப் பயன்படுத்தி பிரித்தெடுக்கப்பட்டன.கீழ் இடது குழுவானது H2B-HLA-A மற்றும் HMGA1-HLA-A வளாகங்களின் வெவ்வேறு புரத-புரத பிணைப்பு தொடர்புகளுடன் (GBVI/WSA dG; kcal/mol) பல்வேறு சாத்தியமான இணக்கங்களைக் காட்டுகிறது.(B) ஒவ்வொரு புரத அமைப்புக்கும் அணு நிலைகளின் (ஹைட்ரஜன் அணுக்கள் தவிர்த்து) நிலையான விலகல் (RMSD).(C) கால அளவு ≥ 10 ns இன் குறிப்பிட்ட இடைவினைகளைக் கருத்தில் கொண்டு பல்வேறு உருவகப்படுத்தப்பட்ட வளாகங்களிலிருந்து இண்டர்மோலிகுலர் புரதம்-புரத ஹைட்ரஜன் பிணைப்பு இடைவினைகள்.h-பத்திர நன்கொடையாளர்-ஏற்றுக்கொள்பவர் கட்ஆஃப் தூரம் 3.5 Å ஆகவும், நன்கொடையாளர்-H-ஏற்றுபவர் கட்ஆஃப் கோணம் ≥ 160°–180° ஆகவும் அமைக்கப்பட்டது.(D) போலியான HLA-A-H2B மற்றும் HLA-A-HMGA1 வளாகங்களில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ≥20 ns வரையிலான, HLA-A புரதம்-புரத தொடர்புகளை அந்தந்த கூட்டாளர்களுடன் உருவாக்கும் லேபிளிடப்பட்ட எச்சங்கள்.புரத கட்டமைப்புகள் 100 ns MDS இன் சராசரி கட்டமைப்பைக் குறிக்கின்றன.(இ) இரண்டு பெப்டைடுகளுக்கு இடையேயான K அல்லது S தொடர்புத் தளத்தின் அடிப்படையில் 100 nsக்கு மேல் H2B-HLA உருவகப்படுத்துதலால் கண்காணிக்கப்படும் இடைவினைகளுடன் ஒப்பிடும்போது HLA-A-H2B மற்றும் HLA-A-HMGA1 வளாகங்களுக்கிடையேயான தொடர்புகள்.வளாகங்கள் /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.குறுக்கு-இணைப்புகளின் மதிப்பீட்டிற்கான நுழைவு மதிப்பு 3.0 ஆக அமைக்கப்பட்டது, மேலும் ≥10 ns எடுத்து MDS இலிருந்து குறிப்பிட்ட இடைவினைகள் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளப்பட்டன.BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) மற்றும் Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) தொகுப்புகளைப் பயன்படுத்தி புரத கட்டமைப்புகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
காலப்போக்கில் HLA-A மூலக்கூறுகளின் நிலைப்புத்தன்மை (நிலையான விலகல்; RMSD அல்லது நிலையான விலகல்; RMSF) வளாகங்களில் H2B அல்லது HMGA1 புரதங்கள் இருப்பது HLA-A ஐ உறுதிப்படுத்துகிறது (படம் 8B, படம் S5).HMGA1 புரதம் HLA-A இன் B2M தளத்துடன் இறுக்கமாக பிணைக்கிறது, HLA-A-HMGA1 அல்லது H2B-HLA-A-HMGA1 வளாகத்தில் HLA-A அமினோ அமிலங்களின் நிலைத்தன்மையைத் தூண்டுகிறது (படம் 8B, படம் S5).குறிப்பாக, HLA எச்சங்கள் ~60-90 மற்றும் ~180-210 ஆகியவை H2B (FIG. 8B) முன்னிலையில் குறைந்த நெகிழ்வுத்தன்மை கொண்டதாக கண்டறியப்பட்டது.H2B மற்றும் HMGA1 ஆனது H2B-HLA-A-HMGA1 வளாகத்தில் HLA-A உடன் H2B அல்லது HMGA1 உடன் மட்டும் பிணைக்கப்படுவதைக் காட்டிலும் HLA-A உடன் சிறந்த பிணைப்பைக் காட்டியது (படம் 8C,D; அட்டவணை S5).ஹைட்ரஜன் பிணைப்பில் ஈடுபட்டுள்ள எச்சங்கள் (MD மாதிரியான உயர் ஆக்கிரமிப்பு ≥ 10 ns) வளாகத்தில் உள்ள CLMS தொடர்பு தளங்களுடன் (K அல்லது S எச்சங்கள்) ஒத்துப்போகின்றன, இது CLMS ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட தொடர்புகள் மிகவும் நம்பகமானவை என்று பரிந்துரைக்கிறது.நம்பகத்தன்மை (படம் 8E ).CLMS மற்றும் MD மாடலிங்கில், HLA-A எச்சங்கள் சுமார் 190-210 மற்றும் சுமார் 200-220 அமினோ அமிலங்கள் முறையே H2B மற்றும் HMGA1 ஐ பிணைப்பதாகக் கண்டறியப்பட்டது (FIG. 8E).
புரோட்டீன்-புரத தொடர்புகள் சில தூண்டுதல்களுக்கு பதிலளிக்கும் வகையில் உள்செல்லுலார் தகவல்தொடர்புக்கு மத்தியஸ்தம் செய்யும் டைனமிக் கட்டமைப்பு நெட்வொர்க்குகளை உருவாக்குகின்றன.பல புரோட்டியோமிக்ஸ் அணுகுமுறைகள் ஒரு புரதத்தின் ஒட்டுமொத்த நிலையான நிலையின் மாற்றங்களைக் கண்டறிவதால், புரத-புரத தொடர்பு இயக்கவியலுக்கு பிணைப்பு இடைமுகங்களைப் பிடிக்க கூடுதல் கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன, மேலும் CLMS அத்தகைய ஒரு கருவியாகும்.இண்டர்ஃபெரான் சிக்னலிங் சிஸ்டம் என்பது சைட்டோகைன் நெட்வொர்க் ஆகும், இது செல்களை சுற்றுச்சூழல் நோய்க்கிருமி மற்றும் உள்ளார்ந்த நோயியல் சமிக்ஞைகளுக்கு பதிலளிக்க அனுமதிக்கிறது, இது இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்களின் துணைக்குழுக்களின் தூண்டுதலில் முடிவடைகிறது.இன்டர்ஃபெரான் தூண்டப்பட்ட புரதங்களின் குழுவில் நாவல் புரதம்-புரத தொடர்புகளை அடையாளம் காண முடியுமா என்பதை தீர்மானிக்க CLMS ஐப் பயன்படுத்தினோம்.இன்டர்ஃபெரான்-பதிலளிக்கக்கூடிய ஃப்ளோ-1 செல் மாதிரியில் உலகளாவிய புரத குறுக்கு-இணைப்பு பகுப்பாய்வு புரத வளாகங்களைப் பிடிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டது.குறுக்கு-இணைக்கப்படாத மற்றும் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட கலங்களிலிருந்து டிரிப்டிக் பெப்டைட்களைப் பிரித்தெடுப்பது, வரையறுக்கப்பட்ட LFQ தீவிரத்துடன் பெப்டைட் எண்ணிக்கை, பாதை செறிவூட்டல் மற்றும் பெப்டைட் நீளம் விநியோகம் ஆகியவற்றை அனுமதிக்கிறது.கேனானிகல் இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்கள் நேர்மறையான உள் கட்டுப்பாட்டாக அடையாளம் காணப்பட்டன, அதே சமயம் MX1, UP18, OAS3 மற்றும் STAT1 போன்ற கேனானிகல் இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டக்கூடிய புரதங்களின் புதிய இடைநிலை மற்றும் உள் மூலக்கூறு குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட சேர்க்கைகள் காணப்பட்டன.பல்வேறு கட்டமைப்பு அம்சங்கள் மற்றும் செயல்பாட்டு பகுதிகளில் உள்ள தொடர்புகள் ஆராயப்பட்டுள்ளன.
HLA-A, MDN1 மற்றும் H2B ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு Flo-1 மற்றும் A549 செல்களில் இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் கண்டறியப்பட்டது மற்றும் IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது.IFNα-சார்ந்த முறையில் H2B உடன் HLA-A வளாகங்கள் இருப்பதை எங்கள் முடிவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன.இந்த இரண்டு வளாகங்களின் இணை-உள்ளூர்மயமாக்கலை மேலும் ஆராய்வதற்கான ஒரு சுவாரஸ்யமான வழியை எங்கள் பணி பிரதிபலிக்கிறது.செல்-வகை-சுயாதீன இன்டர்ஃபெரான்-மத்தியஸ்த புரத தொடர்புகளை அடையாளம் காண செல் கோடுகளின் குழுவிற்கு CLMS அணுகுமுறையை விரிவுபடுத்துவது சுவாரஸ்யமாக இருக்கும்.இறுதியாக, H2BFS-HLA-A-HMGA1 வளாகத்தில் ஈடுபட்டுள்ள புரதங்களின் இணக்க இயக்கவியலைப் புரிந்துகொள்ள மாற்று அணுகுமுறையாக MD மாடலிங்கைப் பயன்படுத்தினோம், இது உள்மூலக்கூறு மற்றும் இடைக்கணிப்பு குறுக்கு பேச்சுகளைக் கண்காணித்தது.CLMS தரவின் அனுமானங்கள் H2BFS, HLA-A மற்றும் HMGA1 புரதங்களின் வெவ்வேறு இணக்கங்களின் சாத்தியத்தை பரிந்துரைக்கின்றன.இந்த நறுக்குதல் புரத வளாகங்களுக்கிடையில் சாத்தியமான வேறுபட்ட இணக்கங்கள் CLMS தரவுத்தொகுப்பில் காணப்பட்டதைப் போன்ற பல தொடர்புகளை வெளிப்படுத்தின.எங்கள் முறையின் முக்கிய பலங்களில் ஒன்று, HLA போன்ற உயர் பாலிமார்பிக் மரபணுக்களை எளிதில் அடையாளம் காண அனுமதிக்கிறது.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இன்டர்ஃபெரான்-தூண்டப்பட்ட சிக்னலிங் நெட்வொர்க்குகள் பற்றிய நமது புரிதலை விரிவுபடுத்தவும், கட்டி நுண்ணிய சூழலில் மிகவும் சிக்கலான இன்டர்செல்லுலர் அமைப்புகளைப் படிப்பதற்கான அடிப்படையை வழங்கவும் CLMS பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை எங்கள் தரவு நிரூபிக்கிறது.
Flo-1 செல்கள் ATCC இலிருந்து பெறப்பட்டு DMEM (கிப்கோ) இல் 1% பென்சிலின்/ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (இன்விட்ரஜன்), 10% கரு போவின் சீரம் (கிப்கோ) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாகப் பராமரிக்கப்பட்டு 37°C மற்றும் 5% CO2 இல் சேமிக்கப்பட்டது.அடைகாத்தல்.IFNα14 (எடின்பர்க் புரோட்டீன் உற்பத்தி வசதியால் தயாரிக்கப்பட்டது) உடன் சிகிச்சையளிக்கப்படுவதற்கு முன்பு செல்கள் 70-80% சங்கமமாக வளர்ந்தன.வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால் மற்ற அனைத்து இரசாயனங்கள் மற்றும் எதிர்வினைகள் சிக்மா ஆல்ட்ரிச்சிலிருந்து வாங்கப்பட்டன.
ஃப்ளோ-1 செல்கள் 6-கிணறு தகடுகளில் வளர்க்கப்பட்டன, அடுத்த நாள் செல்கள் 10 ng/ml IFNα14 உடன் 24 மணிநேரத்திற்கு சுமார் 80% சங்கமத்திற்கு சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன.செல்கள் பிபிஎஸ் மூலம் மூன்று முறை கழுவப்பட்டு, பிபிஎஸ்ஸில் புதிதாக தயாரிக்கப்பட்ட டிஎஸ்எஸ் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) (டிஎம்எஸ்ஓவில் கரைக்கப்பட்டது) உடன் 5 நிமிடம் 37 டிகிரி செல்சியஸ். இறுதி செறிவு 0.5 எம்எம் வரை இணைக்கப்பட்டது.டிஎஸ்எஸ் குறுக்கு இணைப்பு எதிர்வினை பிபிஎஸ்ஸால் மாற்றப்பட்டது மற்றும் எஞ்சிய டிஎஸ்எஸ் பிபிஎஸ்ஸில் 15 நிமிடங்களுக்கு 37 டிகிரி செல்சியஸில் 20 எம்எம் டிரிஸ் (பிஎச் 8.0) சேர்ப்பதன் மூலம் தணிக்கப்பட்டது.செல்கள் ஸ்கிராப்பிங் மூலம் சேகரிக்கப்பட்டு குறைந்த பிணைப்பு குழாய்களில் (ஆக்சிஜன்) சேகரிக்கப்பட்டன.
செல் பெல்லட் 300 µl யூரியா லிசிஸ் பஃபருடன் (8 M யூரியா, 0.1 M டிரிஸ், pH 8.5) அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு அவ்வப்போது நடுங்கியது.அனைத்து மையவிலக்கு நடவடிக்கைகளும் 8 ° C இல் 14,000 xg இல் செய்யப்பட்டன.லைசேட்டை 10 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்து, மேலோட்டத்தை ஒரு புதிய குழாய்க்கு மாற்றவும்.மீதமுள்ள தெளிவான துகள்கள் 150 μl இரண்டாவது லிசிஸ் பஃப்பரில் (2 M யூரியா, 2% (w/v) SDS (சோடியம் டோடெசில் சல்பேட்)) 30 நிமிடங்கள் அல்லது அதற்கு மேல் ஒரே மாதிரியான அக்வஸ் கரைசல் கிடைக்கும் வரை கரைக்கப்பட்டது.லைசேட் 20 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது மற்றும் முந்தைய கட்டத்தில் பெறப்பட்ட லைசேட்டுடன் சூப்பர்நேட்டன்ட் கலக்கப்பட்டது.மைக்ரோ பிளேட் நடைமுறைகளுக்கான உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி மைக்ரோ பிசிஏ மதிப்பீட்டைப் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) பயன்படுத்தி புரதச் செறிவு மதிப்பிடப்பட்டது.மாதிரிகள் திரவ நைட்ரஜனில் விரைவாக உறைந்து -80 ° C இல் சேமிக்கப்பட்டன.
சுமார் 100 μg கரையக்கூடிய குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட புரதம் விஸ்னீவ்ஸ்கி மற்றும் பலர் விவரித்தபடி மாற்றியமைக்கப்பட்ட வடிகட்டுதல் மாதிரி தயாரிப்பு நெறிமுறை (FASP) ஐப் பயன்படுத்தி செயலாக்கப்பட்டது.69 சுருக்கமாக, புரதமானது 200 µl யூரியா பஃபருடன் (0.1 M டிரிஸில் 8 M யூரியா, pH 8.5), சுழல் மற்றும் பாதியாகக் குறைக்கப்படுகிறது.அனைத்து மையவிலக்கு படிகளும் 25 ° C இல் 14,000 xg இல் செய்யப்பட்டன.குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட புரத லைசேட்டின் முதல் பாதியானது அல்ட்ராசெல்-10 சவ்வு (மெர்க்) பொருத்தப்பட்ட 10 kDa மைக்ரோகான் மையவிலக்கு வடிகட்டி சாதனத்திற்கு மாற்றப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து வடிகட்டியில் 25 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.பின்னர் புரதத்தின் இரண்டாவது பாதியை வடிகட்டியில் சேர்த்து, அதே படிகளை மீண்டும் செய்யவும்.யூரியா பஃப்பரில் 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) சேர்ப்பதன் மூலம் புரத மீட்பு செய்யப்பட்டது.600 ஆர்பிஎம்மில் தெர்மோமிக்சரில் 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு மீட்பு தூண்டப்பட்டது.கூடுதலாக, நெடுவரிசை மையவிலக்கு மற்றும் குறைக்கப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட புரதம் யூரியா பஃப்பரில் 100 μl 50 mM அயோடோஅசெட்டமைடைப் பயன்படுத்தி அல்கைலேட் செய்யப்பட்டது.அல்கைலேஷன் எதிர்வினை அறை வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்கள் இருட்டில் மேற்கொள்ளப்பட்டது.நெடுவரிசையைச் சுழற்று, 100 µl யூரியா பஃபரைக் கொண்டு நெடுவரிசைச் சுவர்களை 3 முறை கழுவி, பின்னர் மையவிலக்கு.அதே செயல்பாடு 100 μl 100 mM அம்மோனியம் பைகார்பனேட்டைப் பயன்படுத்தி 3 முறை செய்யப்பட்டது.டிரிப்சினைசேஷனுக்கு முன், சேகரிப்பு குழாயை புதியதாக மாற்றவும்.50 எம்எம் அம்மோனியம் பைகார்பனேட் மற்றும் டிரிப்சின் பஃப்பரில் (ப்ரோமேகா) நீர்த்த 1 μl டிரிப்சின் கொண்ட செரிமான இடையகத்தைச் சேர்க்கவும்.டிரிப்சின் மற்றும் புரதத்தின் விகிதம் சுமார் 1:33 இல் பராமரிக்கப்பட்டது, மேலும் செரிமான எதிர்வினைகள் ஒரே இரவில் 37 ° C. ஈரப்பதமான அறையில் அடைகாத்தன.குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட பெப்டைட் 25 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு மூலம் வடிகட்டியிலிருந்து நீக்கப்பட்டது.வடிகட்டியில் 50 μl 0.5 M NaCl சேர்ப்பதன் மூலம் பெப்டைட் மீட்பு மேம்படுத்தப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து 25 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.
C18 மைக்ரோ ஸ்பின் நெடுவரிசைகள் (ஹார்வர்ட் எப்பேரடஸ்) சிறிய மாற்றங்களுடன் Bouchal et al.70 விவரித்த நெறிமுறையைப் பின்பற்றி குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட டிரிப்டிக் பெப்டைட்களை நீக்குவதற்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன.சுருக்கமாக, அசிட்டோனிட்ரைலில் (AcN) (மெர்க்) 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் (FA) மூன்று கழுவுதல்கள் மற்றும் 0.1% FA இரண்டு கழுவுதல்களுடன் C18 ஸ்பின் நெடுவரிசைகள் செயல்படுத்தப்பட்டன.நெடுவரிசை 15 நிமிடங்களுக்கு 0.1% FA உடன் நீரேற்றம் செய்யப்பட்டது.ஸ்பின் நெடுவரிசைகளில் மாதிரிகளை ஏற்றவும் மற்றும் 0.1% FA உடன் 3 முறை கழுவவும்.உப்பு நீக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் 0.1% FA இல் 50%, 80% மற்றும் 100% AcN ஐப் பயன்படுத்தி ஒரு படிநிலை சாய்வுடன் தொடர்ச்சியாக நீக்கப்பட்டன.மீதமுள்ள திரவம் முற்றிலும் மறையும் வரை மாதிரிகள் ஸ்பீட்வாக் பிளஸ் செறிவூட்டியில் (எப்பன்டார்ஃப்) உலர்த்தப்பட்டன.நீக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் 2.5% AcN இல் 100 μl 0.08% ட்ரைஃப்ளூரோஅசெடிக் அமிலத்தில் கரைக்கப்பட்டன மற்றும் செறிவுகள் NanoDrop 2000 (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) இல் அளவிடப்பட்டன.ஒரு மாதிரிக்கு தோராயமாக 1 μg குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட பெப்டைட் LC-MS/MS அமைப்பில் செலுத்தப்பட்டது.
ஆர்பிட்ராப் எக்ஸ்ப்ளோரிஸ் 480 மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டருடன் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) இணைக்கப்பட்ட அல்டிமேட் 3000 ஆர்எஸ்எல்சி நானோ எல்சி சிஸ்டத்தில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் பிரிக்கப்பட்டன.C18 PepMap100 sorbent மற்றும் 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ஆகியவற்றால் நிரம்பிய 300 µm ஐடி, 5 மிமீ நீளமுள்ள µ-முன் நெடுவரிசை C18 பிடிப்பு நெடுவரிசையில் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் சேகரிக்கப்பட்டன.பம்ப் ஃப்ளோ செட்டை 5 µl/min 0.08% டிரைஃப்ளூரோஅசெட்டிக் அமிலம் 2.5% AcN இல் கரைக்கவும்.குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் 75 μm உள் விட்டம் மற்றும் 150 மிமீ நீளம் கொண்ட பகுப்பாய்வு இணைக்கப்பட்ட சிலிக்கா நெடுவரிசையில் பிரிக்கப்பட்டன, 2 μm பெப்மேப் சர்பென்ட் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) நிரப்பப்பட்டது.மொபைல் கட்டங்கள் A மற்றும் B ஆகியவை முறையே தண்ணீரில் 0.1% FA மற்றும் அசிட்டோனிட்ரைலில் 0.1% FA ஆகியவற்றைக் கொண்டிருந்தன.சாய்வு 2.5% B இல் தொடங்கி 90 நிமிடங்களில் 40% B ஆகவும், அடுத்த 2 நிமிடங்களில் 90% B ஆகவும் அதிகரிக்கிறது.மொபைல் கட்ட கலவை 10 நிமிடங்களுக்கு 90% B இல் பராமரிக்கப்பட்டது, பின்னர் 2 நிமிடங்களுக்கு மேல் 2.5% B ஆகக் குறைக்கப்பட்டது.நெடுவரிசை அடுத்த சுழற்சிக்கு முன் 8 நிமிடங்களுக்கு 2.5% B இல் சமநிலைப்படுத்தப்பட்டது.பகுப்பாய்வு நெடுவரிசையிலிருந்து நீக்கப்பட்ட குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் ஒரு நானோ எலக்ட்ரோஸ்ப்ரே அயனியாக்கம் (NSI) மூலத்தில் அயனியாக்கம் செய்யப்பட்டு ஒரு எக்ஸ்ப்ளோரிஸ் 480 மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) செலுத்தப்பட்டது.
ஆர்பிட்ராப் எக்ஸ்ப்ளோரிஸ் 480 மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் நேர்மறை தரவு தொடர்பு பயன்முறையில் இயங்குகிறது.m/z 350 Th முதல் m/z 2000 Th வரையிலான வரம்பு அமைப்புகளுடன் 120,000 தெளிவுத்திறனில் பிரிவு பயன்முறையில் முழு ஸ்கேன் செய்யப்பட்டது.இயல்பாக்கப்பட்ட AGC இலக்கு 300% ஆக அதிகபட்ச உள்ளீடு நேரமான 50ms ஆக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.பெப்டைட்களுக்கு மோனோஐசோடோபிக் பீக் கண்டறிதல் நிறுவப்பட்டுள்ளது.மிகக் குறைவான முன்னோடிகள் காணப்பட்டால், கட்டுப்பாடு தளர்வு அளவுரு சரி என அமைக்கப்படும்.முன்னோடியின் குறைந்தபட்ச அயனி வலிமை 5.0e3 ஆக அமைக்கப்பட்டது மற்றும் +8 வரையிலான முன்னோடி சார்ஜ் நிலைகள் சோதனைகளில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன.
தரவு தொடர்பு பயன்முறையில் முக்கிய ஸ்கேன்களுக்கு இடையிலான சுழற்சி நேரம் 2.5 வினாடிகளாக அமைக்கப்பட்டது.முன்னோடி அயனியின் முதல் துண்டு துண்டான பிறகு டைனமிக் வெகுஜன விலக்கு 20 வினாடிகளுக்கு அமைக்கப்பட்டது.முன்னோடி தனிமைப்படுத்தல் சாளரம் 2 Th ஆக அமைக்கப்பட்டது.நிலையான மோதல் ஆற்றல் பயன்முறையுடன் இயல்பாக்கப்பட்ட மோதல் ஆற்றலின் வகையானது தரவு சார்ந்த MS/MS ஸ்கேனில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.மோதல் ஆற்றல் 30% ஆக அமைக்கப்பட்டது.ஆர்பிட்ராப் தீர்மானம் 15,000 ஆகவும், AGC இலக்கு 100% ஆகவும் அமைக்கப்பட்டது.தனிப்பயன் அதிகபட்ச ஊசி நேரம் 60 மில்லி விநாடிகளாக அமைக்கப்பட்டுள்ளது.
குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் புரத-புரத நெட்வொர்க்கைக் கண்காணிப்பதற்கு முன், மாதிரிகளில் கண்டறியக்கூடிய பெப்டைடுகள்/புரதங்களைக் கண்டறிய MaxQuant தொகுப்பு (பதிப்பு 1.6.12.0)26,27 ஐப் பயன்படுத்தி மூலக் கோப்புகளை செயலாக்கினோம்.கூடுதலாக, இதேபோன்ற புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகள் IFNα உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் சிகிச்சையளிக்கப்படாத இணைக்கப்படாத ஃப்ளோ -1 மாதிரிகளில் செய்யப்பட்டன.உள்ளமைந்த தேடுபொறியான Andromeda27 ஐப் பயன்படுத்தி MS/MS தரவு UniProt மனித தரவுத்தளத்தில் (www.uniprot.org) (ஆகஸ்ட் 12, 2020 பதிவேற்றப்பட்டது, 75,093 உள்ளீடுகளைக் கொண்டுள்ளது) தேடப்பட்டது.நொதியின் தனித்தன்மை மற்றும் டீமைடேஷன் (N, Q) மற்றும் ஆக்சிஜனேற்றம் (M) ஆகியவற்றின் பல்வேறு மாற்றங்களைக் குறிப்பிடாமல் தேடல் மேற்கொள்ளப்பட்டது.முன்னோடி வெகுஜன சகிப்புத்தன்மை 20 ppm ஆகவும், தயாரிப்பு அயனிகள் 0.02 Da ஆகவும் அமைக்கப்பட்டன.ஆரம்ப மற்றும் அதிகபட்ச நிறை விலகல் 10 ppm ஆக அமைக்கப்பட்டது.பெப்டைட்டின் அதிகபட்ச நிறை 4600 Da ஆக அமைக்கப்பட்டது மற்றும் வரிசை ஒற்றுமை 7 மற்றும் 25 அமினோ அமிலங்கள் (aa) இடையே அமைக்கப்பட்டது.பெர்சியஸ் நிரலைப் பயன்படுத்தி மேலும் புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (பதிப்பு 1.6.10.45).புரதத்தின் நிறமாலை தீவிரத்தை இயல்பாக்குவதன் மூலம் புரத உள்ளடக்கம் கணக்கிடப்பட்டது (LFQ தீவிரம்; பெயரிடப்படாத அளவு) 27 மற்றும் தீவிர மதிப்புகள் Log2 ஆக மாற்றப்பட்டன.R (v 4.1.2) இல் உள்ள pheatmap (v1.0.12) தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி அவற்றின் பெப்டைட் தீவிரத்தால் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்களின் படிநிலைக் கிளஸ்டரிங் உருவாக்கப்பட்டுள்ளது.IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட புரதங்களுக்கான ரியாக்டோம் பாதை தரவுத்தளத்தைப் பயன்படுத்தி பாதை செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, அவை சிகிச்சையளிக்கப்படாத மாதிரிகளுடன் ஒப்பிடும்போது நான்கு மடங்குக்கு மேல் செயல்படுத்தப்பட்டன.
LC-MS/MS ஆல் கண்காணிக்கப்படும் புரத வளாகங்களின் லைசின் (K) அல்லது செரின் (S) குறிப்பிட்ட இரசாயன குறுக்கு இணைப்புகளை அடையாளம் காண்பது குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைட்களுக்கான (SIM-XL) ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபிக் அடையாள இயந்திரத்தை (SIM-XL) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.முதலாவதாக, இன்டர்ஃபெரான்-தொடர்புடைய (IFN) டிஎன்ஏ சேத எதிர்ப்பு கையொப்பம் (ஐஆர்டிஎஸ்) மரபணுக்களுக்கு இடையிலான சாத்தியமான தொடர்புகள் பதரியா மற்றும் பலர்.28 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஐஆர்டிஎஸ் புரத தரவுத்தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி ஆராயப்பட்டன.முழு மனித UniProt இன் அனைத்து நிபந்தனைகளையும் மறுநிகழ்வுகளையும் திரையிடுவது கணக்கீட்டு ரீதியாக தீவிரமானது, எனவே முழு மனித UniProt தரவுத்தளமும் (www.uniprot.org) (12 ஆகஸ்ட் 2020 அன்று பதிவிறக்கப்பட்டது, IFNα-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட ரிபீட்களுக்கு எதிராக 75,093 உள்ளீடுகள் உள்ளன).உயர் நம்பிக்கை தொடர்புகளுக்கான வடிப்பான்களில் ஒன்று.பெறப்பட்ட இந்த உயர் முக்கியத்துவம் வாய்ந்த இடைவினைகள் அனைத்து மறுநிகழ்வுகள் மற்றும் நிபந்தனைகளிலும் விரிவுபடுத்தப்பட்டு சோதிக்கப்பட்டன.
சிம்-எக்ஸ்எல்லில், கிராஸ்லிங்கருக்கு (எக்ஸ்எல்) டிஎஸ்எஸ் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் எக்ஸ்எல் எடை மாற்றம் மற்றும் மாற்றியமைத்தல் எடை மாற்றம் முறையே 138.06 மற்றும் 156.07 என அமைக்கப்பட்டது.பின்வரும் குறுக்கு இணைப்பு எதிர்வினை தளங்கள் கருதப்படுகின்றன: KK, KS மற்றும் KN-TERM, நிருபர் அயனிகள் இல்லாமல்.முன்னோடி மற்றும் துண்டு ppm இரண்டும் 20 ஆகவும், Xrea வரம்பு 0.15 ஆகவும் அமைக்கப்பட்டது.டிரிப்சின் முற்றிலும் குறிப்பிட்டதாகக் கருதப்பட்டது, மேலும் உயர் ஆற்றல் C-பொறி (HCD) துண்டாக்கும் முறை செயல்படுத்தப்பட்டது.XCorr டைனமிக் டிபி குறைப்பு வரம்பு மற்றும் டைனமிக் டிபி குறைப்புக்கான பெப்டைட்களின் குறைந்தபட்ச எண்ணிக்கை முறையே 2.5 மற்றும் 2 என அமைக்கப்பட்டது.மற்ற அளவுருக்கள்: மோனோஐசோடோப் நிகழ்தகவு மற்றும் உச்சநிலை தற்செயல் வெட்டு, ஒரு ஸ்ட்ராண்டிற்கு குறைந்தபட்சம் 4 ஏஏ எச்சங்கள் மற்றும் அதிகபட்ச ஸ்ட்ராண்ட் சார்ஜ், மற்றும் 3 அதிகபட்சம் தவறவிட்ட பிளவுகள்.இதன் விளைவாக தைக்கப்பட்ட 2D வரைபடங்கள் (SIM-XL) இல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன மற்றும் 2D வரைபடங்களை உருவாக்க xQuest28 வரைகலை பிரதிநிதித்துவம் பயன்படுத்தப்பட்டது.புரோட்டீன் கட்டமைப்புகளில் புரோட்டீன் குறுக்கு இணைப்புகள் PyMol இல் வழங்கப்படுகின்றன (PyMOL மூலக்கூறு வரைகலை அமைப்பு, பதிப்பு 2.0 ஷ்ரோடிங்கர், LLC).
"மறைக்கப்பட்ட மார்கோவ் முறை"யின் ஹோமோலஜி மாடலிங் மற்றும் செயல்படுத்தல் கொள்கைகளைப் பயன்படுத்தி Phyre2 சேவையகத்தைப் (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ஐப் பயன்படுத்தி புரோட்டீன் மாதிரி கட்டமைப்புகள் உருவாக்கப்பட்டன.Phyre2 அறியப்பட்ட புரத கட்டமைப்புகளுடன் வரிசை சீரமைப்பு அடிப்படையில் மாதிரி கட்டமைப்புகளை உருவாக்குகிறது.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 மற்றும் MDN1 புரதங்களுக்கு, டெம்ப்ளேட் கட்டமைப்புகள் 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 மற்றும் 6i2665 பயன்படுத்தப்பட்டன.கூடுதலாக, AlphaFold71 MX1, UBP18 மற்றும் ROBO1 ஆகியவற்றின் அமைப்பும் பரிசீலிக்கப்பட்டது.BIOVIA Discovery Studio Visualizer தொகுப்பு (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) மற்றும் மூலக்கூறு இயக்க சூழல் தொகுப்பு (MOE; கெமிக்கல் கம்ப்யூட்டிங் குரூப் இன்க்., மாண்ட்ரீல், கியூபெக், கனடா) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி புரத அமைப்பு காட்சிப்படுத்தப்பட்டது.