ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 இரசாயனத் தொழிலுக்கான டூப்ளக்ஸ் வெல்டட் டியூப், SPECC1L இன் குறைபாடு பிளவுபட்ட மூட்டுகளின் நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்க வழிவகுக்கிறது மற்றும் மண்டை நரம்பு முகடு செல்கள் உதிர்வதைக் குறைக்கிறது.

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள்.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்கவும்).கூடுதலாக, தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை பாணிகள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 இரசாயனத் தொழிலுக்கான டூப்ளக்ஸ் வெல்டட் டியூப்

Liaocheng Sihe SS மெட்டீரியல் கோ., லிமிடெட்.துருப்பிடிக்காத எஃகு தடையற்ற குழாய்கள், பிரகாசமான அனீல்டு குழாய்கள், தடையற்ற சுருள் குழாய்கள் போன்றவற்றில் நிபுணத்துவம் பெற்ற ஒரு முன்னணி உற்பத்தியாளர் ஆவார்.வாடிக்கையாளர்களுக்கு வசதியாக, நாங்கள் வெல்டிங் குழாய்கள் மற்றும் குழாய்களையும் வைத்துள்ளோம்.Liaocheng Sihe SS மெட்டீரியல் கோ., லிமிடெட்.மிகவும் மேம்பட்ட உற்பத்தி மற்றும் சோதனை உபகரணங்களைக் கொண்டுள்ளது.உங்கள் தேவையை நாங்கள் முழுமையாக பூர்த்தி செய்ய முடியும்.மிகவும் கண்டிப்பான தரத்தின்படி, எங்களால் உற்பத்தி செய்யப்படும் குழாய்கள் எப்போதும் சரியான OD மற்றும் WT சகிப்புத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளன.சகிப்புத்தன்மை கட்டுப்பாடு என்பது தரநிலைகளுக்கு கண்டிப்பாக இணங்குகிறது.எங்கள் தயாரிப்புகள் எப்போதும் வாடிக்கையாளர்களுடன் திருப்தி அடைகின்றன.வாடிக்கையாளர்கள் எங்கள் தயாரிப்புகளை வாங்கியதால் அதிக லாபம் கிடைத்தது.
a) OD (வெளி விட்டம்): 3.18mm முதல் 101.6mm வரை
b) WT (சுவர் தடிமன்): 0.5mm முதல் 20mm வரை
c) நீளம்: வாடிக்கையாளரின் தேவைக்கேற்ப
ஈ) தரநிலைகள் : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 போன்றவை
இ) செயல்முறை முறை: ERW, EFW போன்றவை

ஒரு ஸ்லைடிற்கு மூன்று கட்டுரைகளைக் காட்டும் ஸ்லைடர்கள்.ஸ்லைடுகளின் வழியாக செல்ல பின் மற்றும் அடுத்த பட்டன்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒவ்வொரு ஸ்லைடையும் நகர்த்த இறுதியில் ஸ்லைடு கன்ட்ரோலர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.
க்ரானியல் நியூரல் க்ரெஸ்ட் செல்கள் (சிஎன்சிசி) கரு நரம்பியல் மடிப்புகளை அகற்றி, தொண்டை வளைவுகளுக்கு இடம்பெயர்கின்றன, அவை பெரும்பாலான இடைமுக அமைப்புகளை உருவாக்குகின்றன.சிஎன்சிசி செயலிழப்பு ஒரு பொதுவான பிறவி குறைபாடு, ஓரோஃபேஷியல் பிளவுக்கான காரணங்களில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது.வித்தியாசமான மற்றும் சிண்ட்ரோமிக் பிளவுகள் உள்ள நோயாளிகளில் ஹெட்டோரோசைகஸ் SPECC1L பிறழ்வுகள் கண்டறியப்பட்டுள்ளன.இங்கே, பண்பட்ட SPECC1L நாக் டவுன் கலங்களில், கேனானிகல் பிசின் சந்தி (AJ) பாகங்கள், β-catenin மற்றும் E-கேடரின் ஆகியவற்றின் மேம்பட்ட கறையை நாங்கள் தெரிவிக்கிறோம், மேலும் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள் AJ இன் நுனி-அடித்தள பரவலைக் காட்டுகின்றன.கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸில் SPECC1L இன் பங்கைப் புரிந்து கொள்ள, Specc1l குறைபாடுள்ள சுட்டி மாதிரியை உருவாக்கினோம்.ஹோமோசைகஸ் மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் கரு மரணம் மற்றும் பலவீனமான நரம்பு குழாய் மூடல் மற்றும் CNCC லேமினேஷன் ஆகியவற்றை வெளிப்படுத்துகின்றன.பிறழ்ந்த நரம்பியல் மடிப்புகளில் AJ புரதக் கறை அதிகரிக்கப்படுகிறது.இந்த AJ குறைபாடு CNCC delamination இல் உள்ள குறைபாட்டுடன் ஒத்துப்போகிறது, AJ கலைப்பு தேவைப்படுகிறது.கூடுதலாக, ஸ்பெக்11 மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் PI3K-AKT சமிக்ஞையைக் குறைத்து, அப்போப்டொசிஸை அதிகரித்துள்ளனர்.விட்ரோவில், காட்டு-வகை கலங்களில் PI3K-AKT சமிக்ஞையின் லேசான தடுப்பு AJ மாற்றங்களைத் தூண்டுவதற்கு போதுமானதாக இருந்தது.முக்கியமாக, SPECC1L நாக் டவுன் மூலம் தூண்டப்பட்ட AJ மாற்றங்கள் PI3K-AKT பாதையை செயல்படுத்துவதன் மூலம் மாற்றியமைக்கப்படும்.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், PI3K-AKT சிக்னலிங் மற்றும் AJ உயிரியலின் புதிய சீராக்கியாக SPECC1L, நரம்புக் குழாய் மூடல் மற்றும் CNCC அடுக்குப்படுத்தலுக்குத் தேவை என்று இந்தத் தகவல்கள் தெரிவிக்கின்றன.
க்ரானியல் நியூரல் க்ரெஸ்ட் செல்கள் (சிஎன்சிசிக்கள்) டார்சல் நியூரோஎக்டோடெர்மிற்கு இடமளிக்கின்றன மற்றும் எபிதீலியல்-மெசன்கிமல் டிரான்சிஷன் (ஈஎம்டி) 1,2,3 ஆகியவற்றை உள்ளடக்கிய ஒரு செயல்முறையின் மூலம் வளரும் நரம்பியல் மடிப்புகளின் நியூரோபிதீலியத்திலிருந்து பிரிக்கப்படுகின்றன.ப்ரீமிகிரேட்டிங் எபிடெலியல் சிஎன்சிசிகள் இடைச்செல்லுலார் சந்திப்புகளை சீர்குலைத்து, முதல் மற்றும் இரண்டாவது ஃபரிஞ்சீயல் வளைவுகளை நிரப்பி, கிரானியோஃபேஷியல் குருத்தெலும்புகளின் பெரும்பகுதியை உருவாக்கும் மெசன்கிமல் சிஎன்சிசிகளாக மாறுகின்றன.எனவே, சிஎன்சிசி செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் மரபணுக்கள், ஓரோஃபேஷியல் பிளவுகள் போன்ற கிரானியோஃபேஷியல் பிறவி முரண்பாடுகளின் காரணங்களில் அடிக்கடி சீர்குலைக்கப்படுகின்றன, இது பொதுவாக அமெரிக்காவில் மட்டும் 1/800 பிறப்புகளைப் பாதிக்கிறது.பிறவி குறைபாடுகளில் ஒன்று8.
எலிகளில் கரு வளர்ச்சியின் 8.5 முதல் 9.5 நாட்களுக்கு இடையில் முன்புற நரம்புக் குழாயை மூடுவதுடன் சிஎன்சிசியின் நீக்கம் ஒத்துப்போகிறது.பல மவுஸ் ஓரோஃபேஷியல் பிளவு-தொடர்புடைய மரபணுக்களின் மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 மற்றும் Pdgfrα12 உட்பட சில வகையான நரம்புக் குழாய் குறைபாட்டை வெளிப்படுத்துகின்றன.இருப்பினும், நரம்பியல் குழாய் மூடல் மற்றும் CNCC அடுக்கின் செயல்முறைகள் சுயாதீனமாக கருதப்படலாம், ஏனெனில் Splotch mutant mouse (Pax3) CNCC அடுக்கு அல்லது இடம்பெயர்வு 13,14 இல் எந்த பாதிப்பும் இல்லாமல் நரம்பு குழாய் மூடலில் குறைபாடுகளை வெளிப்படுத்துகிறது.CNCC பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் நரம்புக் குழாய் மூடுதலில் குறைபாடுகள் உள்ள கூடுதல் சுட்டி மாதிரிகள் இந்த இரண்டு செயல்முறைகளின் பொதுவான மூலக்கூறு அடிப்படையை வரையறுக்க உதவும்.
நியூரோபிதெலியல் செல்களிலிருந்து சிஎன்சிசியை தனிமைப்படுத்த, பிசின் சந்திப்புகளை (ஏஜேக்கள்) கலைக்க வேண்டும், அவை புரத வளாகங்களால் ஆனவை, மற்றவற்றுடன், ஈ-கேடரின், β-காடெனின், α-இ-கேடெனின் மற்றும் ஆக்டின் இழைகளுடன் தொடர்புடைய α-ஆக்டினின் 2. மிகை அழுத்த ஆய்வுகள் நரம்பு மடிப்புகளில் உள்ள ஈ-கேடரின் சிஎன்சிசி டிலாமினேஷனில் ஒரு குறைப்பு அல்லது தாமதத்தைக் காட்டியது.மாறாக, ஈ-கேடரின் அடக்குதலானது ஆரம்ப நிலைப்படுத்தலில் விளைகிறது15,16.CNCC அடுக்கின் போது EMTக்கு மத்தியஸ்தம் செய்யும் பல காரணிகள் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) மற்றும் மேட்ரிக்ஸ் மெட்டாலோபுரோட்டினேஸ்கள் (MMPகள்) போன்ற எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸ் (ECM) மறுவடிவமைப்பு புரதங்கள், இருப்பினும் CNcytoskeles நேரடியானவை. இன்னும் அறியப்படவில்லை.PI3K-AKT பாதையானது ஈ-கேடரின் அளவை எதிர்க்கிறது, முக்கியமாக புற்றுநோய் ஆராய்ச்சியிலிருந்து.எலிகளில் PDGFα-அடிப்படையிலான PI3K-AKT சிக்னலின் இழப்பு பிளவு அண்ணம் மற்றும் நரம்புக் குழாய் குறைபாடுகள் உட்பட மண்டையோட்டு அசாதாரணங்களுக்கு வழிவகுக்கிறது என்று சமீபத்திய ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன.இருப்பினும், PI3K-AKT பாதை மற்றும் CNCC அடுக்கில் AJ நிலைத்தன்மை ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு தெளிவாக இல்லை.
சாய்ந்த பிளவு (ObFC) அல்லது Tessier IV18 க்ளெஃப்ட் என அறியப்படும் வாயில் இருந்து கண் வரை நீண்டு செல்லும் கடுமையான பிளவு கொண்ட இருவர்களில் SPECC1L ஆனது முதல் பிறழ்ந்த மரபணுவாக இருப்பதை நாங்கள் முன்பே கண்டறிந்தோம்.SPECC1L பிறழ்வுகள் தன்னியக்க மேலாதிக்க Opitz G/BBB நோய்க்குறி (OMIM #145410) கொண்ட இரண்டு பல தலைமுறை குடும்பங்களில் அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன, இதில் பாதிக்கப்பட்ட நபர்கள் அதிக தூரம் மற்றும் பிளவு உதடு/அண்ணம் ஆகியவற்றை வெளிப்படுத்தினர். .ஓபிட்ஸ் ஜி/பிபிபி நோய்க்குறியின் பாதிக்கும் மேற்பட்ட வழக்குகள் எக்ஸ்-இணைக்கப்பட்டவை (OMIM #300000) மற்றும் MID1 மரபணுவில் ஏற்படும் பிறழ்வுகளால் ஏற்படுகின்றன, இது நுண்குழாய்-தொடர்புடைய செல் எலும்புக்கூட்டின் புரதம் 22 ஐ குறியாக்குகிறது.SPECC1L, நுண்குழாய்கள் மற்றும் ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டனுடன் தொடர்புடைய ஒரு புரதம், செல் ஒட்டுதல் மற்றும் இடம்பெயர்வு 18 ஆகியவற்றின் போது ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டன் மறுவடிவமைப்பிற்குத் தேவையான சமிக்ஞையை மத்தியஸ்தம் செய்யலாம் என்று நாங்கள் அனுமானிக்கிறோம்.இன் விட்ரோ மற்றும் விவோ ஆய்வுகள் மூலம், PI3K-AKT சிக்னலிங் மூலம் AJ ஸ்திரத்தன்மையின் புதிய சீராக்கியாக SPECC1L ஐ இப்போது விவரிக்கிறோம்.செல்லுலார் மட்டத்தில், SPECC1L குறைபாடு பான்-AKT புரதத்தின் அளவைக் குறைத்தது மற்றும் AJ இன் நுனி-அடித்தள பரவலில் அதிகரிப்பு ஏற்பட்டது, இது AKT பாதையின் இரசாயன செயலாக்கத்தால் நீக்கப்பட்டது.விவோவில், ஸ்பெக்11-குறைபாடுள்ள கருக்கள் பலவீனமான நரம்புக் குழாய் மூடல் மற்றும் குறைக்கப்பட்ட CNCC பிரித்தலைக் காட்டுகின்றன.எனவே, SPECC1L ஆனது, முகத்தின் மார்போஜெனீசிஸின் போது சாதாரண CNCC செயல்பாட்டிற்குத் தேவைப்படும் மிகவும் ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட செல் ஒட்டுதல் அடிப்படையிலான சமிக்ஞையில் செயல்படுகிறது.
செல்லுலார் மட்டத்தில் SPECC1L இன் பங்கை வகைப்படுத்த, SPECC1L18 இல் முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட நிலையான ஆஸ்டியோசர்கோமா செல் லைன் U2OS பற்றாக்குறையைப் பயன்படுத்தினோம்.SPECC1L (kd) நாக் டவுனைக் கொண்ட இந்த நிலையான U2OS செல்கள், SPECC1L டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்களின் அளவுகளில் மிதமான (60-70%) குறைவைக் கொண்டிருந்தன, ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டனின் இடம்பெயர்வு மற்றும் மறுசீரமைப்பு 18. இதற்கு மாறாக, கடுமையான நிலையற்ற குறைவு SPECC1L மைட்டோடிக் குறைபாடுகளுக்கு வழிவகுக்கும் என நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது 23 .மேலும் குணாதிசயத்தில், எங்கள் நிலையான SPECC1L-kd செல்கள் மிக உயர்ந்த சங்கமத்தில் உருவ அமைப்பை மாற்றியதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1).தனிப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு செல்கள் மற்றும் குறைந்த சங்கமத்தில் உள்ள kd செல்கள் ஒரே மாதிரியாக இருந்தன (படம் 1A,D).24 மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு, கட்டுப்பாட்டு செல்கள் அவற்றின் கனசதுர வடிவத்தைத் தக்கவைத்துக்கொள்கின்றன (படம். 1B, E), SPECC1L-kd செல்கள் நீளமானது (படம். 1C, F).செல் வடிவத்தில் இந்த மாற்றத்தின் அளவு, கட்டுப்பாட்டு செல்கள் மற்றும் கேடி செல்கள் (திரைப்படம் 1) ஆகியவற்றின் விவோ லைவ் இமேஜிங் மூலம் கைப்பற்றப்பட்டது.சங்கம கலங்களில் SPECC1L இன் பங்கைத் தீர்மானிக்க, முதலில் அதன் வெளிப்பாட்டை ஆய்வு செய்தோம்.SPECC1L புரத அளவுகள் இணைவு (படம் 1G) மீது அதிகரித்ததைக் கண்டறிந்தோம், அதேசமயம் SPECC1L டிரான்ஸ்கிரிப்ட் அளவுகள் அதிகரிக்கவில்லை (படம் 1H).கூடுதலாக, செல் அடர்த்தி அதிகரித்ததால், SPECC1L புரதம் செல்களுக்கு இடையேயான எல்லைகளில் (படம். 2A-E) குவிந்து, சவ்வு-தொடர்புடைய β-catenin (படம். 2A'-E') உடன் ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்ந்துள்ளது.ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டன் 18,23 உடன் SPECC1L இன் தொடர்பைக் கருத்தில் கொண்டு, SPECC1L ஆக்டின் அடிப்படையிலான பிசின் சந்திப்புகளுடன் (AJ) தொடர்பு கொள்கிறது என்று நாங்கள் கருதுகிறோம்.
(AF) SPECC1L நாக் டவுன் (DF) செல்கள் கட்டுப்பாட்டு U2OS கலங்களுடன் (AC) ஒப்பிடும்போது அதிக சங்கமத்தில் (F) நீள்கின்றன.வெவ்வேறு செல் அடர்த்திகளுக்கு நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்த ஆறு நேரப் புள்ளிகளில் (T1, T3, T6) மூன்று இங்கே காட்டப்பட்டுள்ளது.(ஜி) வெஸ்டர்ன் பிளட் பகுப்பாய்வு, SPECC1L புரதமானது கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் குறைந்த அளவிலான சங்கமத்துடன் ஒப்பிடும்போது அதிக அளவிலான சங்கமத்தில் நிலைப்படுத்தப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது.SPECC1L இன் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட் எதிர்பார்க்கப்படும் 120 kDa இசைக்குழு மற்றும் அதிக மூலக்கூறு எடை பட்டையைக் காட்டுகிறது, மொழிபெயர்ப்பிற்குப் பின் மாற்றியமைக்கப்படலாம் (*).வெஸ்டர்ன் பிளட் பகுப்பாய்வு குறைந்த மற்றும் அதிக சங்கமத்திற்கான அதே நிலைமைகளின் கீழ் செய்யப்பட்டது.SPECC1L குறைந்த மற்றும் அதிக சங்கமத்தில் உள்ள படங்கள் அதே பிளாட்டில் இருந்து எடுக்கப்பட்டது.அதே கறை அகற்றப்பட்டு β-ஆக்டின் ஆன்டிபாடி மூலம் மீண்டும் பரிசோதிக்கப்பட்டது.(எச்) அளவு RT-PCR பகுப்பாய்வு SPECC1L டிரான்ஸ்கிரிப்ட் நிலைகளில் குறிப்பிடத்தக்க மாற்றங்களைக் காட்டவில்லை.பிழை பார்கள் நான்கு சுயாதீன சோதனைகளிலிருந்து SEM களைக் குறிக்கின்றன.
(AE) SPECC1L நாக் டவுன் (kd) உடன் U2OS கலங்களில் செல் வடிவ பகுப்பாய்வையும் AJ மாற்றங்களையும் இயல்பாக்குவதற்கு செல் அடர்த்தியின் வரம்பைக் குறிக்கும் ஆறு நேரப் புள்ளிகளை (T1-T6) தேர்ந்தெடுத்தோம்.இந்த நேரப் புள்ளிகளில் முதல் ஐந்தில் ஒற்றை செல்கள் (T1), 50-70% சிறிய செல் கிளஸ்டர்களின் இணைவு (T2), kd செல்களை மறுவடிவமைக்காமல் இணைதல் (T3), kd செல்களை மறுவடிவமைத்தல் (T4) மற்றும் 24 மணிநேர மாற்றங்கள் ஆகியவை அடங்கும்.kd (T5) கலங்களின் பின்புற வடிவத்தில்.SPECC1L புரதம் முக்கியமாக T1 (A) இல் உள்ள சைட்டோபிளாஸில் சிதறடிக்கப்பட்டது, ஆனால் அதன் குவிப்பு அடுத்தடுத்த நேர புள்ளிகளில் (B-E, அம்புகள்) இன்டர்செல்லுலர் எல்லைகளில் காணப்பட்டது.(FJ) β-catenin, AJ வளாகத்துடன் தொடர்புடைய செல்களுக்கிடையேயான எல்லைகளில் இதேபோன்ற திரட்சியைக் காட்டுகிறது.(A'-E') SPECC1L மற்றும் β-catenin ஆகியவை செல் எல்லைகளில் அதிக செல் அடர்த்தியில் (அம்புகள்) ஒன்றுடன் ஒன்று படிவதைக் காட்டுகின்றன.(F'-J') SPECC1L-kd கலங்களில், குறைந்த செல் அடர்த்தியில் (F'-H') β-catenin படிதல் சாதாரணமாகத் தோன்றும், ஆனால் செல் வடிவம் மாறும்போது விரிவடைகிறது (I', J'; அம்புகள்), AJ என்பதைக் குறிக்கிறது. மாறிவிட்டன.பார்கள் = 10 µm.
SPECC1L குறைபாட்டின் விளைவை AJ இல் தீர்மானிக்க முயற்சித்தோம்.F-actin, myosin IIb, β-catenin மற்றும் E-cadherin24,25,26,27 உள்ளிட்ட பல AJ-தொடர்புடைய குறிப்பான்களைப் பயன்படுத்தினோம்.முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி SPECC1L-kd கலங்களில் ஆக்டின் அழுத்த இழைகள் அதிகரித்தன (படம். 3A,B) 18 .ஆக்டின் இழைகளுடன் தொடர்புடைய Myosin IIb விட்ரோவில் உள்ள SPECC1L-kd செல்களில் இதேபோன்ற அதிகரிப்பைக் காட்டியது (படம். 3C,D).AJ-தொடர்புடைய β-catenin செல் சவ்வில் உள்ள கேடரினுடன் பிணைக்கிறது, இது கட்டுப்பாட்டு க்யூபோசைட்டுகளில் ஒரு சாதாரண "தேன் கூடு" வெளிப்பாடு வடிவத்தைக் காட்டுகிறது (படம். 3E,G).சுவாரஸ்யமாக, கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோபியைப் பயன்படுத்தி தட்டையான படங்களில், β-கேடனின் (படம். 3E,F) மற்றும் E-கேதரின் (படம். 3G,H) ஆகியவை ஒன்றிணைந்த SPECC1L-குறைபாடுள்ள செல்களின் செல் சவ்வில் படிந்திருப்பது நீட்டிக்கப்பட்ட கறையின் முக்கிய வடிவங்களைக் காட்டியது.Kd கலங்களில் AJ-தொடர்புடைய β-catenin கறையின் இந்த விரிவாக்கம் சங்கமத்தில் மிகவும் உச்சரிக்கப்பட்டது, ஆனால் செல் வடிவத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களுக்கு முன்னதாகவே தோன்றியது (படம். 2F-J, F'-J').இந்த நீட்டிக்கப்பட்ட AJ கறையின் இயற்பியல் தன்மையைத் தீர்மானிக்க, டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி (TEM) மூலம் SPECC1L-kd U2OS கலங்களின் நுனி-அடித்தள மேற்பரப்பில் உள்ள செல் எல்லைகளை ஆய்வு செய்தோம் (படம் 3I, J).AJ (அம்புகள்) குறிக்கும் தனி எலக்ட்ரான் அடர்த்தியான பகுதிகளைக் கொண்ட கட்டுப்பாட்டு செல்கள் (படம். 3I) க்கு மாறாக, kd செல்கள் (படம். 3J) அபிகோபாசல் விமானத்தில் AJ இன் அதிக எலக்ட்ரான் அடர்த்தியைக் குறிக்கும் பெரிய, தொடர்ச்சியான பகுதிகளைக் காட்டியது..கூடுதலாக, குறுக்குவெட்டுப் பிரிவுகளில், kd செல்களில் (படம். S1A,B) விரிவான செல் சவ்வு மடிப்புகளைக் கண்டோம், இது β-catenin மற்றும் E-கேதரின் ஸ்டைனிங் பேண்டுகளின் (படம். 3F,H) நீட்டிக்கப்பட்ட வடிவத்தை விளக்குகிறது.AJ களில் SPECC1L இன் பங்கிற்கு ஆதரவாக, β-catenin ஆனது SPECC1L உடன் இணைந்த U2OS கலங்களின் லைசேட்டுகளில் (படம். 3K) இணை இம்யூனோபிரெசிபிட்டேட் செய்யப்பட்டது.AJ குறிப்பான்களுக்கான நீட்டிக்கப்பட்ட இம்யூனோஸ்டைனிங்குடன், TEM பகுப்பாய்வு SPECC1L குறைபாடு AJ நுனி-அடித்தள அடர்த்தி மற்றும் மாறுபாட்டை அதிகரிக்கிறது என்ற எங்கள் கருதுகோளுடன் ஒத்துப்போகிறது.
(AH) 48 மணிநேர பிந்தைய இணைவு (T6; A, B) இல் kd செல்களில் எஃப்-ஆக்டின் படிதல் அதிகரித்தது.எஃப்-ஆக்டின் (சி, டி) உடன் தொடர்புடைய மயோசின் IIb இன் மாற்றப்பட்ட கறை.SPECC1L-kd (F, H) கலங்களில் கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் (E, G) β-catenin மற்றும் E-கேடரின் சவ்வு கறை படிந்திருக்கும் மென்மையான முறை மேம்படுத்தப்பட்டது.பார்கள் = 10 µm.(I-J) நுனி-அடித்தள இடைச்செல்லுலார் சந்திப்பைக் கவனிக்கும் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்கள்.கட்டுப்பாட்டு செல்கள் ஒட்டும் சந்திப்புகளை (I, அம்புகள்) குறிக்கும் தனித்துவமான எலக்ட்ரான் அடர்த்தியான பகுதிகளைக் காட்டுகின்றன.இதற்கு நேர்மாறாக, SPECC1L-kd கலங்களில் உள்ள முழு நுனி-அடித்தள சந்திப்பும் எலக்ட்ரான் அடர்த்தியாக (ஜே, அம்புகள்) தோன்றியது, இது அதிகரித்த அடர்த்தி மற்றும் பிசின் சந்திப்புகளின் சிதறலைக் குறிக்கிறது.(K) β-catenin ஆனது SPECC1L உடன் இணைந்த U2OS செல் லைசேட்டுகளில் இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேட் செய்யப்பட்டது.நான்கு சுயாதீன சோதனைகளில் ஒன்றைக் குறிக்கும் ஒரு இடத்திலிருந்து எடுக்கப்பட்ட படம்.
கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸில் SPECC1L இன் பங்கைப் புரிந்து கொள்ள, DTM096 மற்றும் RRH048 (BayGenomics, CA) ஆகிய இரண்டு சுயாதீன ES ட்ராப் செல் லைன்களைப் பயன்படுத்தி Specc1l குறைபாடுள்ள மவுஸ் மாதிரியை உருவாக்கினோம். .4A, படம் S2).டிகோய் திசையன் செருகலின் மரபணு இருப்பிடம் முழு மரபணு வரிசைமுறையால் தீர்மானிக்கப்பட்டது மற்றும் PCR ஆல் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம். S2).இரண்டு மரபணு பொறி வடிவமைப்புகளும் கைப்பற்றப்பட்டவுடன் Specc11-lacZ நிருபர்களின் சட்டக இணைவை அனுமதித்தன.எனவே, X-gal staining மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் lacZ வெளிப்பாடு Specc11 வெளிப்பாட்டின் குறிகாட்டியாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.இரண்டு அல்லீல்களும் ஒரே மாதிரியான lacZ வெளிப்பாடு வடிவங்களைக் காட்டியது, இன்ட்ரான் 1 இல் உள்ள DTM096 மரபணுப் பொறியானது இன்ட்ரான் 15 இல் உள்ள RRH048 ஐ விட வலுவான வெளிப்பாட்டைக் காட்டுகிறது (காட்டப்படவில்லை).எவ்வாறாயினும், E8.5 (படம் 4B), நரம்புக் குழாய் மற்றும் E9.5 மற்றும் E10.5 (படம் 4C,D) இல் முக செயல்முறைகள் (படம் 4C,D) மற்றும் வளரும் கைகால்களில் குறிப்பாக வலுவான வெளிப்பாட்டுடன் Specc1l பரவலாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. E10 இல்.5 மற்றும் கண்கள் (படம் 4D).E10.5 இல் உள்ள முதல் குரல்வளை வளைவில் உள்ள SPECC1L வெளிப்பாடு சிஎன்சிசி பரம்பரைக்கு இணங்க எபிதீலியம் மற்றும் அடிப்படையான மெசன்கைம் 18 இல் இருப்பதாக நாங்கள் முன்பு தெரிவித்தோம்.CNCC இல் SPECC1L வெளிப்பாட்டை சோதிக்க, E8.5 நரம்பு மடிப்புகளை (படம் 4E-J) மற்றும் E9.5 மண்டை ஓடு பிரிவுகளை (படம் 4K-) செய்தோம்.E8.5 இல், SPECC1L படிந்த நரம்பியல் மடிப்புகள் தீவிரமாக (படம் 4E, H), NCC குறிப்பான்கள் (படம் 4G, J) படிந்த செல்கள் உட்பட.E9.5 இல், SPECC1L (படம். 4K, N) AP2A (படம். 4L, M) அல்லது SOX10 (படம். 4O, P) உடன் இணைந்த CNCC ஐ வலுவாகக் கறைப்படுத்தியது.
(A) ES DTM096 (intron 1) மற்றும் RRH048 (intron 15) செல் குளோன்களில் டிகோய் வெக்டார் செருகலைக் காட்டும் மவுஸ் Specc11 மரபணுவின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்.(BD) E8.5 இலிருந்து E10.5 வரையிலான Specc1l வெளிப்பாட்டைக் குறிக்கும் ஹெட்டோரோசைகஸ் Specc1lDTM096 கருக்களின் lacZ கறை.NE = neuroectoderm, NF = நரம்பு மடிப்பு, PA1 = முதல் தொண்டை வளைவு.(EP) E8.5 (NF; EJ) நரம்பியல் மடிப்புகள் மற்றும் E9.5 (KP) மண்டை ஓடு பிரிவுகளில் NCC குறிப்பான்கள் AP2A மற்றும் SOX10 உடன் SPECC1L இம்யூனோஸ்டைனிங்.AP2A (F, G; அம்புக்குறிகள்) மற்றும் SOX10 (I, J; அம்புக்குறிகள்) என பெயரிடப்பட்ட செல்கள் உட்பட E8.5 (E, H; அம்புக்குறிகள்) நரம்பு மடிப்புகளில் SPECC1L கறை பரவலாகக் காணப்பட்டது.E9.5 இல், SPECC1L ஆனது AP2A (L, M; அம்புகள்) மற்றும் SOX10 (O, P; அம்புகள்) என பெயரிடப்பட்ட இடம்பெயர்ந்த CNCCகள் (K, N; அம்புகள்) வலுவாக படிந்துள்ளது.
ஹெட்டோரோசைகஸ் ஸ்பெக்1எல்டிடிஎம்096/+ மற்றும் ஸ்பெக்1எல்ஆர்ஆர்எச்048/+ எலிகளுக்கு இடையே கடப்பது இரண்டு மரபணு பொறி அல்லீல்களும் நிரப்பியாக இல்லை என்பதையும், மரபணு பொறி அலீலுக்கான கலவை ஹீட்டோரோசைகோட்கள் மற்றும் கரு ஹோமோசைகோட்கள் கரு உயிரிழப்பைக் காட்டுகின்றன (அட்டவணை S1).மெண்டலியன் விகிதங்கள் பிறக்கும் போது ஹெட்டோரோசைகோட்களின் உயிர்வாழ்வு விகிதத்தில் குறைவதைக் குறிக்கிறது (எதிர்பார்க்கப்பட்டது 1.34 எதிராக 2.0).ஹெட்டோரோசைகோட்கள் மத்தியில் குறைவான பெரினாட்டல் இறப்பு விகிதத்தை நாங்கள் குறிப்பிட்டோம், சிலவற்றில் கிரானியோஃபேஷியல் முரண்பாடுகள் இருந்தன (படம். S3).இருப்பினும், இந்த பெரினாட்டல் கிரானியோஃபேஷியல் பினோடைப்களின் குறைந்த ஊடுருவல் அவற்றின் அடிப்படை நோயியல் இயற்பியல் வழிமுறைகளைப் படிப்பதை கடினமாக்குகிறது.எனவே, ஹோமோசைகஸ் ஸ்பெக் 11 மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் கரு ஆபத்தான பினோடைப்பில் கவனம் செலுத்தினோம்.
பெரும்பாலான கூட்டு ஹீட்டோரோசைகஸ் அல்லது ஹோமோசைகஸ் ஸ்பெக்1எல்டிடிஎம்096/ஆர்ஆர்எச்048 விகாரி கருக்கள் E9.5–10.5 (படங்கள் 5A-D) க்குப் பிறகு உருவாகவில்லை, மேலும் நரம்புக் குழாய் முன்புறமாக மூடவில்லை (படம் 5B, D) மற்றும் சில சமயங்களில் பின்பகுதியில் மூடப்பட்டது (காட்டப்படவில்லை) ..இந்த மண்டை நரம்புக் குழாய் மூடல் குறைபாடு CNCC எனக் குறிக்கப்பட்ட DLX2 உடன் E10.5 இல் எஞ்சியிருக்கும் நரம்பியல் மடிப்புகளுடன் தொடர்புடையது, இது எந்தப் பிரிவும் இல்லை என்பதைக் குறிக்கிறது (படம் 5A'-D').CNCC இன் ஒட்டுமொத்த அளவும் குறைக்கப்பட்டதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, Wnt1-Cre மற்றும் ROSAmTmG உடன் எங்கள் மரபணுப் பொறி வரிகளில் GFP உடன் CNCC வரிகளைக் குறியிட்டோம்.முழு கருக்களிலிருந்தும் வரிசைப்படுத்தப்பட்ட GFP+ NCC மற்றும் GFP- (RFP+) NCC அல்லாதவற்றை ஸ்ட்ரீம் செய்கிறோம்.E9.5 இல், ஓட்டம்-வரிசைப்படுத்தப்பட்ட GFP-லேபிளிடப்பட்ட CNCCகளின் விகிதம் WT மற்றும் பிறழ்ந்த கருக்களுக்கு இடையில் கணிசமாக மாறவில்லை (காட்டப்படவில்லை), இது சாதாரண CNCC விவரக்குறிப்பைக் குறிக்கிறது.எனவே, வெளிப்படும் நரம்பியல் மடிப்புகளில் (படம் 5B') மீதமுள்ள Wnt1-Cre மற்றும் DLX2 கறைகள் குறைபாடுள்ள CNCC லேயரிங் காரணமாக இருக்கலாம், SPECC1L-kd கலங்களில் காணப்படுவது போல், AJ செல்கள் அதிகரித்த அடர்த்தி அல்லது சிதறல் காரணமாக இருக்கலாம்.நரம்பியல் மடிப்பில் CNCC இருப்பதை உறுதிப்படுத்த NCC குறிப்பான்களான SOX10, AP2A மற்றும் DLX2 ஐப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 5E-R).E8.5 இல், WT (படம் 5E, G, I) மற்றும் Specc1l விகாரி (படம் 5F, H, J) ஆகிய மூன்று NCC குறிப்பான்களுக்கும் நரம்பு மடிப்பு கறை காணப்பட்டது.E9.5 இல், NCC குறிப்பான்கள் WT பிரிவுகளில் (படம் 5M, O, Q) இடம்பெயர்ந்த NCCயின் படிந்திருக்கும் போது, ​​Specc1l பிறழ்ந்த கருக்களின் (படம் 5N, P, R) வெளிப்படும் நரம்பு மடிப்புகளில் எஞ்சிய NCC கறை காணப்பட்டது.SOX10 மற்றும் DLX2 ஆகியவை CNCCகளை நகர்த்துவதைக் குறிப்பதால், SPECC1L-குறைபாடுள்ள CNCCகள் இடம்பெயர்வுக்குப் பிந்தைய விவரக்குறிப்பை அடைகின்றன, ஆனால் நரம்பியல் மடிப்புகளிலிருந்து இடம்பெயரத் தவறிவிட்டதாக இந்த முடிவு தெரிவிக்கிறது.
ஸ்பெக் 11 குறைபாடு குறைபாடுள்ள நரம்புக் குழாய் மூடல், மண்டை நரம்பு முகடு செல்கள் மற்றும் AJ களின் சிதைவுக்கு வழிவகுக்கிறது.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') என லேபிளிடப்பட்ட மைகிரேட்டிங் க்ரானியல் நியூரல் க்ரெஸ்ட் செல்களை (CNCC) சுமந்து செல்லும் கரு.இதற்கு நேர்மாறாக, ஸ்பெக்11 விகாரமான கருக்கள் திறந்த நரம்பியல் மடிப்புகள் (பி), அம்புக்குறிகள்) மற்றும் இடம்பெயர்ந்திருக்காத சிஎன்சிசிகள் (பி', அம்புக்குறிகள்) ஆகியவற்றைக் காட்டுகின்றன.(C, D') பிரகாசமான புலப் படங்கள் (C, D') மற்றும் இம்யூனோஸ்டைனிங் (C', D') CNCC மார்க்கர் DLX2 of E10.5 WT கருக்கள் (C, C') மற்றும் Specc1l (D, D').WT E10.5 கருக்களில், DLX2-பாசிட்டிவ் CNCC கில் வளைவுகளை (C', அம்புகள்) காலனித்துவப்படுத்துகிறது, அதே சமயம் மரபுபிறழ்ந்தவர்களில், வெளிப்படையான நரம்பியல் மடிப்புகளிலும் (D', அம்புகள்) மற்றும் முதல் குரல்வளை வளைவுகளிலும் (D', அம்புகள்).) சில கறைகளுடன் (அம்புகள்) மோசமான நீக்கம் மற்றும் CNCC இடம்பெயர்வு ஆகியவற்றைக் குறிக்கிறது.ER) E8.5 (E-L) மற்றும் E9.5 (M-R) நிலைகளில் உள்ள WT மற்றும் Specc1l பிறழ்ந்த கருக்களின் பிரிவுகள் NCC குறிப்பான்கள் SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) மற்றும் DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 இல், காட்டு-வகை நரம்பு மடிப்பு (NF) மற்றும் பிறழ்ந்த பிரிவுகளில் NCC படிதல் காணப்பட்டது.E8.5 WT (K) மற்றும் பிறழ்ந்த (L) இல் SOX10 மற்றும் β-catenin ஆகியவற்றின் இணை-கறை, நரம்பு மடிப்புகளில் செல் எல்லைகளில் அதிகரித்த β-catenin கறையை வெளிப்படுத்தியது.E9.5 இல், இடம்பெயர்ந்த CNCCகளின் (M, O, Q) காட்டு-வகைக் கறை காணப்பட்டது, அதே சமயம் மரபுபிறழ்ந்தவர்களில், அடுக்குப்படுத்தப்படாத CNCCகள் திறந்த நரம்பு மடிப்புகளை (N, P, R) படிந்தன.(S-Z) விவோ ஏஜே லேபிளிங் பகுப்பாய்வில் WT மற்றும் Specc11DTM096/RRH048 கருக்கள் E9.5 பிறழ்வுடன்.தோராயமான பிரிவு விமானம் மேல் வலது மூலையில் காட்டப்பட்டுள்ளது.பிறழ்ந்த திசுக்களின் பிரிவுகளில், எஃப்-ஆக்டின் (எஸ், டி) மற்றும் மயோசின் IIb (யு, வி) ஆகியவற்றின் கறை அதிகரித்தது.படம் 3 இல் உள்ள இன் விட்ரோ முடிவுகளைப் போலவே, பிறழ்ந்த கருக்களிலும், β-கேடனின் (W, X) மற்றும் E-கேதரின் (Y, Z) ஆகியவற்றிற்கான மேம்படுத்தப்பட்ட சவ்வு கறை காணப்பட்டது.(AA-BB) நுனி-அடித்தளக் கலத்தின் எல்லைக்கு அப்பால் பார்க்கும் ஒரு காட்டு-வகை கருவின் ஒரு பிரிவின் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப், பிசின் சந்திப்புகளை (AA, அம்புகள்) குறிக்கும் ஒரு தனித்துவமான எலக்ட்ரான்-அடர்ந்த பகுதியைக் காட்டுகிறது.இதற்கு நேர்மாறாக, ஸ்பெக்11 விகாரி கருக்களின் (பிபி, அம்புகள்) பிரிவுகளில், முழு அபிகோபாசல் சந்திப்பும் எலக்ட்ரான் அடர்த்தியானது, இது பிசின் சந்திப்புகளின் அதிகரித்த அடர்த்தி மற்றும் சிதறலைக் குறிக்கிறது.
மாற்றப்பட்ட AJ காரணமாக லேயரிங் குறைக்கப்பட்டது என்ற எங்கள் கருதுகோளைச் சோதிக்க, Specc1l பிறழ்ந்த கருக்களின் (படம் 5S-Z) வெளிப்படும் நரம்பு மடிப்புகளில் AJ லேபிளிங்கை ஆய்வு செய்தோம்.ஆக்டின் அழுத்த இழைகள் (படம். 5 எஸ், டி) அதிகரிப்பதையும், ஆக்டின் இழைகளில் (படம் 5 யூ, வி) மயோசின் IIB கறை படிந்ததை அதனுடன் இணைந்த உள்ளூர்மயமாக்கலையும் நாங்கள் கவனித்தோம்.முக்கியமாக, β-catenin (Fig. 5W,X) மற்றும் E-cadherin (Fig. 5Y,Z) ஆகியவற்றின் கறை படிந்ததை நாம் அவதானித்தோம்.E8.5 கருக்களின் நரம்பு மடிப்புகளில் (படம் 5K, L) NCCயின் β-catenin கறை படிந்ததையும் ஆய்வு செய்தோம்.β-catenin கறையானது Specc1l பிறழ்ந்த நரம்பு மடிப்புகளில் (படம். 5L மற்றும் K) வலுவாகத் தோன்றியது, இது AJ மாற்றங்கள் தொடங்கியுள்ளன என்று கூறுகிறது.E9.5 கருக்களின் மண்டை ஓடு பிரிவுகளின் எலக்ட்ரான் மைக்ரோகிராஃப்களில், WT (படம். 5AA, BB மற்றும் S1E-H) உடன் ஒப்பிடும்போது Specc1l பிறழ்ந்த கருக்களில் பரவலான எலக்ட்ரான்-அடர்த்தியான கறை படிவதை மீண்டும் கவனித்தோம்.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் SPECC1L-kd U2OS கலங்களில் எங்களின் இன் விட்ரோ முடிவுகளை ஆதரிக்கின்றன, மேலும் நமது பிறழ்ந்த கருக்களில் சிஎன்சிசி ஸ்டெடிபிகேஷனுக்கு முந்தைய AJ ஸ்டைனிங் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
AKT செயல்பாடு மற்றும் E-கேதரின் நிலைத்தன்மை ஆகியவற்றுக்கு இடையே உள்ள அறியப்பட்ட விரோத உறவைக் கருத்தில் கொண்டு, 17,28 PI3K-AKT சமிக்ஞையின் ஈடுபாட்டை நாங்கள் அனுமானித்தோம்.கூடுதலாக, E9.5-10.5 இல் உயிரிழப்பிலிருந்து (<5%) தப்பித்து, அதற்குப் பதிலாக E13.5 (படம். S3) இல் குடியேறிய சில பிறழ்ந்த கருக்களில் சப்பெடெர்மல் கொப்புளங்களை நாங்கள் கவனித்தோம்.சப்பெடெர்மல் வெசிகல்ஸ் என்பது PDGFRα12 அடிப்படையில் குறைக்கப்பட்ட PI3K-AKT சிக்னலின் ஒரு அடையாளமாகும்.Fantauzzo மற்றும் பலர்.(2014) PdgfraPI3K/PI3K பிறழ்ந்த கருக்களில் PDGFRα-அடிப்படையிலான PI3K செயல்பாட்டின் இடையூறு சப்பீடெர்மல் வெசிகிள்ஸ், நியூரல் டியூப் குறைபாடுகள் மற்றும் பிளவு அண்ணம் பினோடைப்களில் விளைகிறது என்று அறிவித்தது.உண்மையில், pan-AKT மற்றும் செயலில் உள்ள பாஸ்போரிலேட்டட் Ser473-AKT இன் அளவுகள் Specc1l விகாரி திசுக்களில் உள்ள விவோவில் E9.5 கரு கைதுக்கு குறைக்கப்பட்டன (படம். 6A-D).பாஸ்போரிலேட்டட் Ser473-AKT இன் அளவுகள் குறைவதால், விவோ (FIG. 6E) மற்றும் இன் விட்ரோ (FIG. 6F) இல் உள்ள pan-AKT அளவுகள் குறைவதால் முற்றிலும் இருக்கலாம்.U2OS செல்கள் செல் வடிவம் மற்றும் AJ அடர்த்தியில் மாற்றங்களுடன் வலுவாக சங்கமிக்கும் போது மட்டுமே இன் விட்ரோ குறைவு காணப்பட்டது (படம் 6D).எனவே, SPECC1L என்பது கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸில் PI3K-AKT சமிக்ஞையின் ஒரு புதிய நேர்மறை சீராக்கி என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது.
(A-E) E8.5 (A,B) மற்றும் E9.5 (C,D) மண்டையோட்டுப் பிரிவுகள் அல்லது E9.5 லைசேட்டுகள் Specc1l பிறழ்ந்த கருக்கள் (E) செயலில் உள்ள பாஸ்போரிலேட்டட் S473-AKT மற்றும் pan-AKT புரதக் குறைப்பு அளவைக் காட்டுகிறது , கட்டுப்பாட்டு WT உடன் ஒப்பிடும்போது.வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங் அதே நிலைமைகளின் கீழ் காட்டு-வகை லைசேட்டுகள் மற்றும் பிறழ்ந்த லைசேட்டுகளில் செய்யப்பட்டது.SPECC1L க்காகக் காட்டப்பட்டுள்ள படங்கள் ஒரு ப்ளாட்டில் இருந்து எடுக்கப்பட்டது.அதே கறை நீக்கப்பட்டு, ஆன்டி-பான்-ஏசிடி மற்றும் β-ஆக்டின் ஆன்டிபாடிகள் மூலம் மீண்டும் பரிசோதிக்கப்பட்டது.E8.5 நரம்பு மடிப்புகளில் (A, B) Pan-AKT அளவுகள் மற்றும் E9.5 மண்டை ஓடு பிரிவுகளில் பாஸ்போரிலேட்டட் S473-AKT அளவுகள் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டன.(F) உயர் சங்கமத்தில் அறுவடை செய்யப்பட்ட SPECC1L-kd U2OS கலங்களின் லைசேட்டுகளில் Pan-AKT அளவுகள் இதேபோல் குறைக்கப்பட்டன.பிழை பார்கள் மூன்று சுயாதீன வெஸ்டர்ன் பிளட் அளவுகளில் இருந்து SEM களைக் குறிக்கின்றன.(GJ) E9.5 இல் உள்ள WT கருக்களின் பிரிவுகள் முறையே KI67 மற்றும் பிளவுபட்ட காஸ்பேஸ் 3 உடன் படிந்துள்ளது, செல் பெருக்கம் (G, G') மற்றும் சிறிய அப்போப்டொடிக் செயல்பாடு (H, H') ஆகியவற்றைக் காட்டுகிறது.ஸ்பெக் 11 விகாரமான கருக்கள் ஒப்பிடக்கூடிய உயிரணு பெருக்கத்தைக் காட்டுகின்றன (I), ஆனால் அப்போப்டொசிஸுக்கு உட்பட்ட உயிரணுக்களின் எண்ணிக்கை கணிசமாக அதிகரித்துள்ளது (J).
பின்னர் பெருக்கம் மற்றும் அப்போப்டொசிஸின் குறிப்பான்களை ஆய்வு செய்தோம்.WT மரபுபிறழ்ந்தவர்களுக்கு 82.5% மற்றும் KI67 ஸ்டைனிங் (p <0.56, Fisher's) மூலம் அளவிடப்படும் Specc1l மரபுபிறழ்ந்தவர்களுக்கு 86.5% பெருக்கக் குறியீட்டுடன் E9.5 கருக்களின் பெருக்கத்தில் (படம் 6E, G ஐ ஒப்பிடும்போது) எந்த வித்தியாசத்தையும் நாங்கள் கவனிக்கவில்லை. சரியான சோதனை).இதேபோல், E8.5 இல் நரம்பியல் மடிப்புகளில் பிளவுபட்ட காஸ்பேஸ் 3 க்கு கறை படிந்ததன் மூலம் அளவிடப்படும் அப்போப்டொசிஸில் எந்த வித்தியாசத்தையும் நாங்கள் கவனிக்கவில்லை கரு கைது (காட்டப்படவில்லை) (காட்டப்படவில்லை).இதற்கு நேர்மாறாக, அனைத்து E9.5 பிறழ்ந்த கருக்களிலும் அப்போப்டொசிஸ் கணிசமாக அதிகரித்தது (படம். 6F, H மற்றும் J).அப்போப்டொசிஸின் இந்த ஒட்டுமொத்த அதிகரிப்பு குறைக்கப்பட்ட PI3K-AKT சமிக்ஞை மற்றும் ஆரம்பகால கரு மரணம்29,30,31 ஆகியவற்றுடன் ஒத்துப்போகிறது.
அடுத்து, எங்கள் kd கலங்களில் AJ மாற்றங்களில் PI3K-AKT சமிக்ஞைக்கான காரணப் பங்கை உறுதிப்படுத்த, கட்டுப்பாடு மற்றும் kd செல்களில் உள்ள பாதையை வேதியியல் முறையில் மாற்றினோம் (படம் 7A-F).சங்கமமான SPECC1L-kd கலங்களில் காணப்பட்ட செல் வடிவ மாற்ற பினோடைப்பை குறிப்பானாகப் பயன்படுத்தினோம், இது தொடர்புடைய செங்குத்து பரிமாணத்திற்கு (அகலம்) நீளமான பரிமாணத்தின் (நீளம்) விகிதத்தைப் பயன்படுத்தி அளந்தோம்.ஒப்பீட்டளவில் வட்டமான அல்லது கனசதுர கலங்களுக்கு 1 விகிதம் எதிர்பார்க்கப்படுகிறது (படம் 7G).செல் வடிவத்துடன் கூடுதலாக, β-catenin ஸ்டைனிங் (படம் 7A'-F') மூலம் AJ மீதான விளைவையும் உறுதிப்படுத்தினோம்.கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் (படம் 7A,C) மற்றும் AJ (படம் 7A') செல் வடிவத்தை மாற்ற, வோர்ட்மேனின் பயன்படுத்தி PI3K-AKT பாதையை தடுப்பது போதுமானது.PI3K-AKT ஆக்டிவேட்டர் SC-79 கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் செல் வடிவத்தை (FIG. 7A, E) அல்லது AJ விரிவாக்கத்தை (FIG. 7A') பாதிக்கவில்லை.SPECC1L-kd கலங்களில், PI3K-AKT பாதையை மேலும் அடக்கியதன் விளைவாக அப்போப்டொசிஸ் அதிகரித்தது (படம். 7B,D) மற்றும் β-catenin ஸ்டைனிங்கில் (Fig. 7B') குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு ஏற்பட்டது, இது எங்களின் இன் விவோ ஹெவி மரபுபிறழ்ந்தவர்களுடன் ஒத்துப்போகிறது.முக்கியமாக, PI3K-AKT பாதையை செயல்படுத்துவது செல் வடிவத்தை கணிசமாக மேம்படுத்தியது (படம் 7B,F) மற்றும் AJ பினோடைப்கள் (படம் 7B").செல் வடிவத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்கள் செல் ரவுண்ட்னெஸ் ரேஷியோ (CCR) என அளவிடப்பட்டு, மேலே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி முக்கியத்துவத்துடன் ஒப்பிடப்பட்டது (FIG. 7G).உண்மையில், கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் (படம். 7G, CCR = 1.56), செல் வடிவத்தை (படம். 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மாற்றுவதற்கு வோர்ட்மேனின் சிகிச்சை போதுமானதாக இருந்தது. SPECC1L இல்.-kd செல்கள் (படம் 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd கலங்களின் வோர்ட்மேனின் சிகிச்சை (படம். 7G, CCR = 3.60, மிகக் குறைவானது) சிகிச்சை அளிக்கப்படாத kd செல்கள் (படம். 7G, CCR = 3.46, மிகக் குறைவானது) அல்லது wortmannin-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு செல்கள் (படம். 7G) விட குறிப்பிடத்தக்கதாக இல்லை., CCR = 3.46, புறக்கணிக்கத்தக்கது) கூடுதலாக செல் நீட்டிப்பை பாதிக்கிறது (7G, CCR = 3.61, மிகக் குறைவு).மிக முக்கியமாக, SC-79 AKT ஆக்டிவேட்டர் SPECC1L-kd கலங்களின் நீளமான பினோடைப்பை மீட்டெடுத்தது (படம். 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).இந்த முடிவுகள் SPECC1L PI3K-AKT சமிக்ஞையை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது மற்றும் SPECC1L இல் மிதமான குறைவு செல் ஒட்டுதலை பாதிக்கிறது, அதே நேரத்தில் வலுவான குறைவு அப்போப்டொசிஸுக்கு வழிவகுக்கிறது (படம் 8).
(A-F') கட்டுப்பாடு (A, C, E) மற்றும் SPECC1L-kd (B, D, F) செல்கள் PI3K-AKT பாத்வே இன்ஹிபிட்டர் வோர்ட்மன்னின் (C, D) அல்லது SC-79 ஆக்டிவேட்டர் (E, F) சிகிச்சையுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது .சிகிச்சையளிக்கப்படாத கட்டுப்பாட்டு செல்கள் சாதாரண β-பூனை செல்லுலார் ஸ்டைனிங் (A') உடன் க்யூபாய்டல் (A) ஆகும், அதே சமயம் kd செல்கள் நீட்டிக்கப்பட்டவை (B) அதிகரித்த β-பூனை கறையுடன் (B').PI3K-AKT பாதையை அடக்கிய பிறகு, β-பூனை விரிவாக்கத்துடன் (C') நீட்டிக்கப்பட்ட (C) செல்களைக் கட்டுப்படுத்துகிறது, அதே நேரத்தில் kd செல்கள் அப்போப்டொசிஸுக்கு (D) உட்படுத்தத் தொடங்கின, இது நமது மிகவும் பிறழ்ந்த கருக்கள் மற்றும் மிகவும் மேம்பட்ட β-பூனையைக் காட்டுகிறது.கறை படிதல் (D').PI3K-AKT பாதையை செயல்படுத்திய பிறகு, கட்டுப்பாட்டு செல்கள் கனசதுரமாக (E) இருந்தது மற்றும் சாதாரண β-பூனை (E') கறையை கொண்டிருந்தது, அதே சமயம் kd செல்கள் கணிசமாக மேம்படுத்தப்பட்ட செல் வடிவம் (F) மற்றும் β-cat (F') படிந்ததைக் காட்டுகிறது. (ஜி) மெட்டாமார்ப் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி, (ஏஎஃப்) செல் வடிவ மாற்றத்தின் அளவு நீளமான பரிமாணத்தின் (நீளம்) செல் ரவுண்ட்னெஸ் விகிதம் (சிசிஆர்) மற்றும் செங்குத்து பரிமாணம் (அகலம்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது.சிகிச்சையளிக்கப்படாத (NT) SPECC1L-kd செல்கள் (CCR = 3.46) கட்டுப்பாட்டு செல்களை விட கணிசமாக நீளமாக இருந்தது (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் PI3K-AKT பாதையை வோர்ட்டின் தடுப்பானது, செல் வடிவத்தில் இதேபோன்ற நீட்சியை ஏற்படுத்த போதுமானதாக இருந்தது (CCR=3.61, p<2.4×10-9).இதேபோல், SPECC1L-kd கலங்களில் SC-79 ஆல் AKT செயல்படுத்துவது, கட்டுப்பாட்டு நிலைகளுக்கு செல் நீட்டிப்பை மீட்டெடுத்தது (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd கலங்களின் வோர்ட்மேனின் சிகிச்சையானது அப்போப்டொசிஸை அதிகரித்தது, ஆனால் சிகிச்சை அளிக்கப்படாத kd (CCR=3.46, ns) அல்லது wortmannin-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு செல்கள் (3.61) ஆகியவற்றுடன் ஒப்பிடும்போது செல் வடிவ மாற்றம் (CCR=3.60) மேலும் அதிகரிக்கவில்லை.ns = முக்கியமில்லை.+/- 50 கலங்களுக்கான SEM அளவீடுகள் காட்டப்பட்டுள்ளன.மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்டைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர வேறுபாடுகள் கணக்கிடப்பட்டன.
(A) PI3K-AKT பாதையின் தடுப்பு மற்றும் செயல்படுத்தலின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம் முறையே AJ மாற்றங்கள் மற்றும் மீட்புக்கு வழிவகுத்தது.(B) SPECC1L மூலம் AKT புரத உறுதிப்படுத்தலுக்கான முன்மொழியப்பட்ட மாதிரி.
ப்ரீமிக்ரேட்டரி சிஎன்சிசிகளுக்கு முன்புற நரம்பியல் மடிப்பு நியூரோபிதெலியல் செல்கள்1,15,32 இலிருந்து பிரிக்க AJ லிசிஸ் தேவைப்படுகிறது.AJ கூறுகளின் கறை அதிகரிப்பு மற்றும் SPECC1L-குறைபாடுள்ள செல்களில் உள்ள நுனி-அடித்தள AJ சமச்சீரற்ற விநியோகத்தின் இழப்பு, விட்ரோ மற்றும் விவோ ஆகிய இரண்டிலும், SPECC1L க்கு β-catenin இயற்பியல் அருகாமையுடன் இணைந்து, SPECC1L AJ உள்ளூர் நிலைத்தன்மையை சரியாக பராமரிக்கிறது என்று பரிந்துரைக்கிறது. அமைப்பின் தசைகள்.ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டன்.ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டன் மற்றும் β-கேடெனின் உடன் SPECC1L இன் தொடர்பு மற்றும் SPECC1L இல்லாத நிலையில் அமுக்கப்பட்ட ஆக்டின் இழைகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு ஆகியவை AJ அடர்த்தியில் காணப்பட்ட அதிகரிப்புடன் ஒத்துப்போகின்றன.மற்றொரு சாத்தியம் என்னவென்றால், SPECC1L-குறைபாடுள்ள கலங்களில் ஆக்டின் ஃபைபர்களின் எண்ணிக்கை அதிகரித்தால், செல்களுக்கு இடையேயான பதற்றத்தில் மாற்றம் ஏற்படுகிறது.செல்லுலார் அழுத்தம் AJ 33 இயக்கவியலைப் பாதிக்கிறது என்பதால், மின்னழுத்த மாற்றங்கள் மேலும் பரவலான AJ 34 க்கு வழிவகுக்கும்.எனவே எந்த மாற்றங்களும் CNCC அடுக்குகளை பாதிக்கும்.
Wnt1 ஆரம்ப நரம்பியல் மடிப்புகளில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, இது நரம்பு முகடு செல்களை உருவாக்குகிறது.எனவே, Wnt1-cre பரம்பரைத் தடமறிதல் NCC35க்கு முந்தைய மற்றும் இடம்பெயர்வதைக் குறிக்கிறது.இருப்பினும், Wnt1 ஆரம்பகால நரம்பு மடிப்புகளான 35,36 இலிருந்து பெறப்பட்ட முதுகெலும்பு மூளை திசு குளோன்களையும் குறிக்கிறது, இது திறந்த நரம்பு மடிப்புகளில் Wnt1 குறிப்பான்களுக்கான E9.5 மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் கறை CNCC அல்ல.NCC குறிப்பான்களான AP2A மற்றும் SOX10க்கான எங்கள் நேர்மறை கறை, Specc11 பிறழ்ந்த கருக்களின் வெளிப்படும் நரம்பு மடிப்புகளில் உண்மையில் CNCC இருப்பதை உறுதிப்படுத்தியது.கூடுதலாக, AP2A மற்றும் SOX10 ஆகியவை ஆரம்பகால இடம்பெயர்ந்த NCCயின் குறிப்பான்களாக இருப்பதால், நேர்மறை கறை இந்த செல்கள் இடம்பெயர்வுக்குப் பிந்தைய CNCC ஆகும், அவை E9.5 ஆல் அடுக்க முடியாது.
SPECC1L மூலம் AJ இன் மூலக்கூறு ஒழுங்குமுறை PI3K-AKT சமிக்ஞை மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது.SPECC1L குறைபாடுள்ள செல்கள் மற்றும் திசுக்களில் AKT சமிக்ஞை குறைக்கப்படுகிறது.Fantauzzo மற்றும் பலர் கண்டுபிடிப்புகள்.கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸில் PI3K-AKT சமிக்ஞைக்கான நேரடி பங்கை ஆதரிக்கிறது.(2014) PDGFRα-அடிப்படையிலான PI3K-AKT சிக்னலின் செயல்பாட்டின் பற்றாக்குறை பிளவு அண்ணம் பினோடைப்பிற்கு வழிவகுக்கிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.U2OS கலங்களில் AJ மற்றும் செல் வடிவத்தை மாற்ற PI3K-AKT பாதையைத் தடுப்பது போதுமானது என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம்.எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளுக்கு இணங்க, கெய்ன் மற்றும் பலர்.எண்டோடெலியல் செல்களில் PI3K α110 சப்யூனிட்டைக் குறைப்பது பெரிசெல்லுலர் β-catenin ஸ்டைனிங்கில் இதேபோன்ற அதிகரிப்புக்கு வழிவகுக்கிறது, இது "இணைப்பு குறியீட்டில்" அதிகரிப்பு என குறிப்பிடப்படுகிறது.இருப்பினும், ஆக்டின் இழைகள் ஏற்கனவே மிகவும் ஒழுங்கமைக்கப்பட்ட எண்டோடெலியல் செல்களில், PI3K-AKT பாதையை அடக்குவது ஒரு தளர்வான செல் வடிவத்தை விளைவிக்கிறது.இதற்கு மாறாக, SPECC1L-kd U2OS செல்கள் நீளமான செல் வடிவத்தைக் காட்டியது.இந்த வேறுபாடு செல் வகை குறிப்பிட்டதாக இருக்கலாம்.PI3K-AKT சிக்னலை அடக்குவது ஆக்டின் சைட்டோஸ்கெலட்டனை நிரந்தரமாக பாதிக்கும் அதே வேளையில், செல் வடிவத்தின் மீதான விளைவு மத்திய ஆக்டின் இழைகளின் அடர்த்தி மற்றும் அமைப்பில் ஏற்படும் மாற்றங்களால் ஏற்படும் பதற்றத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது.U2OS கலங்களில், SPECC1L-குறைபாடுள்ள AJ மாற்றம் மற்றும் மீட்டெடுப்பின் குறிப்பானாக செல் வடிவ மாற்றங்களை மட்டுமே பயன்படுத்தினோம்.முடிவில், SPECC1L குறைபாட்டில் AKT பாதையைத் தடுப்பது AJ நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்கிறது மற்றும் CNCC இல் நீக்கத்தை குறைக்கிறது என்று நாங்கள் அனுமானிக்கிறோம்.
சுவாரஸ்யமாக, SPECC1L இல்லாத நிலையில் பாஸ்போரிலேட்டட் 473-AKT அளவுகளுக்கு கூடுதலாக விட்ரோ மற்றும் விவோவில் pan-AKT அளவுகள் குறைக்கப்பட்டன, இது AKT புரத நிலைத்தன்மை அல்லது விற்றுமுதல் மட்டத்தில் PI3K-AKT சமிக்ஞையை ஒழுங்குபடுத்த பரிந்துரைக்கிறது.SPECC1L மற்றும் MID1 மரபணுக்கள், இரண்டும் ஓபிட்ஸ்/ஜிபிபிபி நோய்க்குறியுடன் தொடர்புடையவை, நுண்குழாய்களை 18,22 உறுதிப்படுத்தும் புரதங்களை குறியாக்கம் செய்கின்றன.SPECC1L மற்றும் MID1 நுண்குழாய் நிலைப்படுத்தலை மத்தியஸ்தம் செய்யும் வழிமுறை முழுமையாக புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை.SPECC1L இன் விஷயத்தில், இந்த நிலைப்படுத்தலில் நுண்குழாய்கள் 18 இன் துணைக்குழுவின் மேம்படுத்தப்பட்ட அசிடைலேஷன் அடங்கும்.AKT போன்ற பிற புரதங்களை நிலைப்படுத்த SPECC1L இதேபோன்ற பொறிமுறையைப் பயன்படுத்துகிறது.AKT புரதத்தில் உள்ள லைசின் எச்சங்களின் அசிடைலேஷன் சவ்வு பரவல் மற்றும் பாஸ்போரிலேஷன் குறைவதற்கு வழிவகுக்கிறது என்று நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.கூடுதலாக, AKT இல் அதே லைசின் எச்சத்தில் K63 சங்கிலியின் எங்கும் பரவுதல் அதன் சவ்வு பரவல் மற்றும் செயல்படுத்தலுக்கு தேவைப்படுகிறது39,40.பல்வேறு உயர் செயல்திறன் ஈஸ்ட் டூ-ஹைப்ரிட் திரைகளில் அடையாளம் காணப்பட்ட SPECC1L புரதங்களுடன் ஊடாடும் பல காரணிகளில், நான்கு - CCDC841, ECM2942, APC மற்றும் UBE2I43 - புரத விற்றுமுதல் அல்லது எங்கும் பரவுதல் அல்லது சுமைலேஷன் மூலம் நிலைப்புத்தன்மை ஆகியவற்றில் உட்படுத்தப்பட்டுள்ளன.SPECC1L ஆனது AKT லைசின் எச்சங்களின் மொழிபெயர்ப்புக்கு பிந்தைய மாற்றத்தில் ஈடுபடலாம், இது AKT நிலைத்தன்மையை பாதிக்கிறது.இருப்பினும், AKT புரதத்தின் உள்ளூர்மயமாக்கல் மற்றும் நிலைத்தன்மையில் SPECC1L இன் முக்கிய பங்கு இன்னும் தெளிவுபடுத்தப்பட உள்ளது.
விவோவில் SPECC1L வெளிப்பாட்டின் கடுமையான குறைபாடுகள் அதிகரித்த AJ மார்க்கர் கறை மற்றும் குறைபாடுள்ள CNCC மேலடுக்கு, அத்துடன் அதிகரித்த அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் ஆரம்பகால கரு மரணம் ஆகியவற்றை ஏற்படுத்தியது.முந்தைய அறிக்கைகள், அப்போப்டொசிஸின் அதிகரித்த அளவுகளைக் கொண்ட மவுஸ் மரபுபிறழ்ந்தவர்கள் நரம்புக் குழாய் குறைபாடுகள் 44,45,46,47 மற்றும் கிரானியோஃபேஷியல் குறைபாடுகள்48 ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையதாகக் காட்டுகின்றன.நரம்பியல் மடிப்புகள் அல்லது தொண்டை வளைவுகளில் அதிகப்படியான உயிரணு இறப்பினால், சரியான மார்போஜெனடிக் இயக்கம் 48,49,50 க்கு தேவையான செல்கள் போதுமான எண்ணிக்கையில் இல்லாமல் இருக்கலாம் என்று பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.இதற்கு நேர்மாறாக, எங்கள் SPECC1L குறைபாடுள்ள செல் கோடுகள் மிதமான குறைக்கப்பட்ட SPECC1L வெளிப்பாட்டுடன், அதிகரித்த செல் இறப்புக்கான ஆதாரம் இல்லாமல் AJ மாற்றங்களை மட்டுமே காட்டியது.இருப்பினும், இந்த Kd செல்களில் PI3K-AKT பாதையின் இரசாயனத் தடுப்பானது அப்போப்டொசிஸை அதிகரித்தது.எனவே, SPECC1L வெளிப்பாடு அல்லது செயல்பாட்டில் மிதமான குறைவு செல் உயிர்வாழ்வை உறுதி செய்கிறது.ஸ்டம்ப்.E9.5—ஒருவேளை குறைக்கப்பட்ட மரபணு பிடிப்புத் திறன் காரணமாக—அவற்றின் நரம்புக் குழாய்களை மூடி, வளர்ச்சியில் பின்னர் நிறுத்த முடியும், பெரும்பாலும் கிரானியோஃபேஷியல் குறைபாடுகளுடன் (படம். S3).மேலும் இதனுடன் ஒத்துப்போகிறது, கிரானியோஃபேஷியல் அசாதாரணங்களுடன் கூடிய ஹெட்டோரோசைகஸ் ஸ்பெக்1எல் கருக்கள் அரிதாகவே நிகழும்-அநேகமாக அதிகரித்த மரபணுப் பிடிப்புத் திறன் காரணமாக இருக்கலாம்-அத்துடன் ஜீப்ராஃபிஷின் கண்டுபிடிப்பு, இதில் இரண்டு SPECC1L ஆர்த்தோலாக்ஸ் (ஸ்பெக்1எல்பி) தாமதமான கரு இழப்பு உட்பட. கீழ் தாடைகள் மற்றும் இருதரப்பு பிளவுகள்51.எனவே, மனித நோயாளிகளில் அடையாளம் காணப்பட்ட ஹெட்டோரோசைகஸ் SPECC1L செயலிழப்பு-செயல்பாட்டு பிறழ்வுகள் கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸின் போது SPECC1L செயல்பாட்டில் சிறிய குறைபாடுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும், இது அவர்களின் ஓரோஃபேஷியல் பிளவுகளை விளக்க போதுமானது.SPECC1L-அடிப்படையிலான இன்டர்செல்லுலார் தொடர்புகளின் ஒழுங்குமுறை பலடோஜெனிசிஸ் மற்றும் ஃபரிஞ்சீயல் வளைவுகளின் இணைவு ஆகியவற்றிலும் பங்கு வகிக்கலாம்.SPECC1L செயல்பாட்டின் மேலதிக ஆய்வுகள், நியூரோபிதெலியல் செல் இயக்கம் மற்றும் கிரானியோஃபேஷியல் மார்போஜெனீசிஸ் ஆகியவற்றில் நரம்புக் குழாய் மூடலின் போது CNCC இல் தற்காலிக இடைச்செல்லுலார் தொடர்புகளின் பங்கை தெளிவுபடுத்த உதவும்.
U2OS ஆஸ்டியோசர்கோமா கட்டுப்பாடு மற்றும் SPECC1L-kd செல்கள் முன்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளன (Saadi et al., 2011).SPECC1L க்கு எதிரான ஆன்டிபாடிகளும் முன்பு வகைப்படுத்தப்பட்டுள்ளன (சாதி மற்றும் பலர்., 2011).ஆன்டி-கேடெனின் ஆன்டிபாடிகள் (முயல்; 1:1000; சாண்டா குரூஸ், டல்லாஸ், டிஎக்ஸ்) (சுட்டி; 1:1000; செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி, டான்வர்ஸ், எம்ஏ), மயோசின் IIb (1:1000; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ் ) , MO) ), இ-கேடரின் (1:1000; அப்காம், கேம்பிரிட்ஜ், MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , கலிபோர்னியா), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி, டான்வர்ஸ், MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher சயின்டிஃபிக், வால்தம், வால்தம் ) , KI67 (1:1000; செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி, டான்வர்ஸ், MA), க்ளீவ்டு காஸ்பேஸ் 3 (1:1000; செல் சிக்னலிங் டெக்னாலஜி, டான்வர்ஸ், MA) மற்றும் β-ஆக்டின் (1:2500; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட். MO) விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி பயன்படுத்தப்பட்டது..ஆக்டின் இழைகள் ஆக்டி-ஸ்டெயின் ரோடமைன் ஃபல்லாய்டின் (சைட்டோஸ்கெலட்டன், டென்வர், கொலராடோ) மூலம் கறைபட்டன.
U2OS கட்டுப்பாட்டு செல்கள் மற்றும் SPECC1L-kd செல்கள் 10% கரு போவின் சீரம் (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ், கார்ல்ஸ்பாட், CA) உடன் கூடுதலாக தரமான உயர் குளுக்கோஸ் DMEM இல் வளர்க்கப்பட்டன.AJ மாற்றங்களுக்காக, 2 x 105 செல்கள் 0.1% போர்சின் ஜெலட்டின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO) மூலம் கண்ணாடியில் விதைக்கப்பட்டு, செல் வடிவத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் கவனித்தது.வெவ்வேறு சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேரப் புள்ளிகளில் செல்கள் சேகரிக்கப்பட்டன: விதைத்த 4 மணிநேரம் (t = 1), விதைத்த 24 மணிநேரம் (t = 2), செல் வடிவத்தில் மாற்றம் இல்லாமல் சங்கமம் (t = 3), செல் வடிவத்தில் மாற்றம் (t = 4) , செல் வடிவம் மாற்றத்திற்குப் பிறகு 24 மணிநேரம் (t = 5) மற்றும் 48 மணிநேரம் செல் வடிவம் மாற்றத்திற்குப் பிறகு (t = 6) (படம் 1, 2, 3).PI3K-AKT பாதையை மாற்றியமைக்க, செல்கள் PI3K-AKT இன்ஹிபிட்டர் வோர்ட்மன்னின் (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) அல்லது SC-79 ஆக்டிவேட்டர் (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams) மூலம் சுட்டிக்காட்டப்பட்ட செறிவுகளில் வளர்க்கப்பட்டன.இரசாயனங்கள் கொண்ட ஊடகம் தினசரி மாற்றப்பட்டது.
சாதாரண கலாச்சார நிலைமைகளின் கீழ் நேரடி கட்டுப்பாடு மற்றும் KD செல்களில் ஃப்ரேம்-பை-ஃபிரேம் பதிவுகள் செய்யப்பட்டன, மேலும் ஒவ்வொரு 10 நிமிடங்களுக்கும் 7 நாட்களுக்கு கட்ட மாறுபாடு படங்கள் சேகரிக்கப்பட்டன.கணினி-கட்டுப்படுத்தப்பட்ட Leica DM IRB தலைகீழ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி ஒரு இயந்திர நிலை மற்றும் QImaging Retiga-SRV கேமராவுடன் இணைக்கப்பட்ட 10 × N-PLAN நோக்கம் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி படங்கள் பெறப்பட்டன.இமேஜிங்கின் போது, ​​செல் கலாச்சாரங்கள் 5% CO2 உடன் ஈரப்பதமான வளிமண்டலத்தில் 37 ° C இல் பராமரிக்கப்படுகின்றன.
Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) இலிருந்து DTM096 மற்றும் RRH048 ஆகிய இரண்டு மரபணுப் பொறி ES செல் கோடுகள் Specc11 குறைபாடுள்ள மவுஸ் கோடுகளை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன.சுருக்கமாக, 129/REJ ES செல்கள் C57BL6 பிளாஸ்டோசிஸ்ட்களில் செலுத்தப்பட்டன.இதன் விளைவாக உருவான சிமெரிக் ஆண் எலிகள் பெண் C57BL6 எலிகளுடன் இனப்பெருக்கம் செய்யப்பட்டு, அகுட்டி கோட் நிறத்துடன் சந்ததிகளை அடையாளம் காண முடிந்தது.ஹீட்டோரோசைகோட்களை அடையாளம் காண மரபணு பொறி திசையன் செருகல்களின் இருப்பு பயன்படுத்தப்பட்டது.எலிகள் 129/REJ;C57BL6 கலவையான பின்னணியில் வைக்கப்பட்டன.மரபணு பொறி வெக்டரின் செருகும் தளத்தின் இடம் RT-PCR, மரபணு வரிசைமுறை மற்றும் மரபணு நிரப்புதல் (துணை படம் 1) மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.இரட்டை ஹீட்டோரோசைகஸ் ஸ்பெக்1எல்ஜிடி எலிகளின் சிஎன்சிசி பரம்பரையைக் கண்டறிய, ROSAmTmG (#007576) மற்றும் Wnt1-Cre (#003829) எலிகள் (ஜாக்சன் லேபரேட்டரி, பார் ஹார்பர், ME) ஆகியவை ROSAmTmG மற்றும் Wnt1-Elet1-Specr1 எம்பிசிஆர்எல் எம்பிஆர்ஐஎல் எம்பிஆர்எஸ்ஐ உருவாக்குகின்றன.கன்சாஸ் பல்கலைக்கழக மருத்துவ மையத்தின் நிறுவன விலங்கு பராமரிப்பு மற்றும் பயன்பாட்டுக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்ட நெறிமுறைகளின்படி எலிகளில் அனைத்து சோதனைகளும் செய்யப்பட்டன.
அறை வெப்பநிலையில் 60 நிமிடங்களுக்கு (1% ஃபார்மால்டிஹைடு, 0.2% குளுடரால்டிஹைடு, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) கருக்கள் நிலைப்படுத்தப்பட்டன.X-gal staining தீர்வு (5 mM பொட்டாசியம் ferricyanide, 5 mM பொட்டாசியம் ஃபெரோசயனைடு, 2 mM MgCl2, 0.01% சோடியம் deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) 37 ° C இல் கறை வளர்ச்சி செய்யப்பட்டது. .1-6 மணி நேரத்திற்குள் °C.கருக்கள் 4% PFA இல் பொருத்தப்பட்டு காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
மேற்கத்திய ப்ளாட்டிங்கிற்காக, செல்கள் செயலற்ற லிசிஸ் பஃப்பரில் (ப்ரோமேகா, ஃபிட்ச்பர்க், டபிள்யூஐ) HALT புரோட்டீஸ் தடுப்பான்களின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், MO) கலவையுடன் இணைக்கப்பட்டன.லைசேட்டுகள் 12% பாலிஅக்ரிலாமைடு மினி-புரோட்டீன் டிஜிஎக்ஸ் ஆயத்த ஜெல்களில் (பயோ-ராட், ஹெர்குலஸ், சிஏ) செயலாக்கப்பட்டு இம்மோபிலன் பிவிடிஎஃப் சவ்வுகளுக்கு (ஈஎம்டி மில்லிபோர், பில்லெரிகா, எம்ஏ) மாற்றப்பட்டது.0.1% ட்வீன் கொண்ட பிபிஎஸ்ஸில் 5% பாலில் சவ்வுகள் தடுக்கப்பட்டன.ஆன்டிபாடிகள் ஒரே இரவில் 4 டிகிரி செல்சியஸ் அல்லது அறை வெப்பநிலையில் ஒரு மணி நேரம் அடைகாக்கப்படுகின்றன.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) சமிக்ஞை உருவாக்கத்திற்கு பயன்படுத்தப்பட்டது.இம்யூனோஸ்டைனிங்கிற்காக, கருக்கள் ஒரே இரவில் 4% PFA/PBS இல் சரி செய்யப்பட்டு கிரையோபிரெசர்ட் செய்யப்பட்டன.1% சாதாரண ஆடு சீரம் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக், வால்தம், எம்ஏ) மற்றும் 0.1% ட்ரைடன் எக்ஸ்-100 (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ், எம்ஓ) ஆகியவற்றைக் கொண்ட பிபிஎஸ்ஸில் திசு கிரையோசெக்ஷன்கள் தடுக்கப்பட்டு, பின்னர் 4 டிகிரி செல்சியஸ் இன்குபேட்டரில் அடைகாக்கப்பட்டது. இரவு.ஆன்டிபாடி மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் (1:1000) 1 மணிநேரத்திற்கு 4°C.கறை படிந்த பகுதிகள் ப்ரோலாங் தங்க ஊடகத்தில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக், வால்தம் எம்.ஏ) வைக்கப்பட்டு, லைக்கா டிசிஎஸ் எஸ்பிஇ கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப்பைப் பயன்படுத்தி தட்டையான படங்கள் பெறப்பட்டன.ஒவ்வொரு இம்யூனோஸ்டைனிங்கும் குறைந்தது இரண்டு பிறழ்ந்த கருக்களின் சிரோசெக்ஷன்களில் மூன்று சுயாதீன சோதனைகளாக செய்யப்பட்டது.ஒரு பிரதிநிதி சோதனை காட்டப்பட்டுள்ளது.
மாற்றியமைக்கப்பட்ட RIPA பஃபரில் (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% கிளிசரால், 2 mM EDTA, மற்றும் HALT ப்ரோடீஸ் இன்ஹிபிட்டர் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச், செயின்ட் லூயிஸ்) ஆகியவற்றில் செல்கள் அடைக்கப்பட்டுள்ளன. சுருக்கமாக, புரோட்டீன் ஜி காந்த மணிகளால் (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ், கார்ல்ஸ்பாட், சிஏ) லைசேட்டுகள் முன்கூட்டியே சுத்திகரிக்கப்பட்டன, பின்னர் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் அடைகாத்தன. SPECC1L எதிர்ப்பு அல்லது IgG புரதம் G புரத மணிகள் SPECC1L ஐப் பிரித்தெடுக்க பயன்படுத்தப்பட்டன மற்றும் மேற்கத்திய பிளாட்டிங் பயன்படுத்தப்பட்டது. மேலே விவரிக்கப்பட்ட -β-catenin ஆன்டிபாடி காட்டப்பட்டுள்ள இணை-IP சோதனைகள் நான்கு சுயாதீன சோதனைகளின் பிரதிநிதிகள்.
கன்சாஸ் பல்கலைக்கழக மருத்துவ மையத்தில் உள்ள எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி மையத்திற்கு நிலையான வளர்ப்பு செல்கள் அல்லது சுட்டி கரு திசுக்கள் வழங்கப்பட்டன.சுருக்கமாக, மாதிரிகள் EMbed 812 ரெசினில் (எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி சயின்சஸ், ஃபோர்ட் வாஷிங்டன், PA) உட்பொதிக்கப்பட்டன, ஒரே இரவில் 60 ° C இல் பாலிமரைஸ் செய்யப்பட்டன, மேலும் 80 nm இல் வைர பிளேடு பொருத்தப்பட்ட லைக்கா UC7 அல்ட்ராமிக்ரோடோமைப் பயன்படுத்தி பிரிக்கப்பட்டன.100 kV Lab6 துப்பாக்கியுடன் பொருத்தப்பட்ட JEOL JEM-1400 டிரான்ஸ்மிஷன் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி பிரிவுகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
இந்தக் கட்டுரையை எப்படி மேற்கோள் காட்டுவது: வில்சன், என்ஆர் மற்றும் பலர்.SPECC1L இன் குறைபாடு பிளவுபட்ட மூட்டுகளின் நிலைத்தன்மையை அதிகரிக்க வழிவகுக்கிறது மற்றும் மண்டை நரம்பு முகடு செல்கள் குறைக்கப்படுகிறது.அறிவியல்.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
செயிண்ட்-ஜீன், ஜே.-பி.நரம்பு மண்டலத்தின் தூண்டல் மற்றும் வேறுபாடு.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
கோர்டெரோ, டிஆர் மற்றும் பலர்.இயக்கத்தில் உள்ள மண்டை நரம்பு முகடு செல்கள்: கிரானியோஃபேஷியல் வளர்ச்சியில் அவற்றின் பங்கு.அமெரிக்கன் ஜர்னல் ஆஃப் மெடிக்கல் ஜெனிடிக்ஸ்.பகுதி A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
போலண்ட், ஆர்பி நியூரோகிறிஸ்டோபதியா: 20 ஆண்டுகளில் அதன் வளர்ச்சி மற்றும் வளர்ச்சி.குழந்தை நல மருத்துவர்.நோயியல்.ஆய்வகம்.மருந்து.17, 1–25 (1997).
மங்கோல்ட் இ., லுட்விக் கே.யு மற்றும் நோட்டன் எம்.எம்.மூலக்கூறு மருத்துவத்தின் போக்குகள் 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
மினு, எம். மற்றும் ரிலே, க்ரானியல் நியூரல் க்ரெஸ்ட் செல் இடம்பெயர்வு மற்றும் கிரானியோஃபேஷியல் வளர்ச்சியின் போது வடிவமைத்தல் ஆகியவற்றின் எஃப்எம் மூலக்கூறு வழிமுறைகள்.டெவலப்மெண்ட் 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
டிக்சன், எம்ஜே, மராசிதா, எம்எல், பீட்டி, டிஎச் மற்றும் முர்ரே, ஜேகே பிளவு உதடு மற்றும் அண்ணம்: மரபணு மற்றும் சுற்றுச்சூழல் தாக்கங்களைப் புரிந்துகொள்வது.இயல்பான கருத்து.மரபியல் 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
இங்க்ராம், சிஆர் மற்றும் பலர்.இண்டர்ஃபெரான்-ஒழுங்குபடுத்தும் காரணி-6 (Irf6)-குறைபாடுள்ள எலிகளில் தோல், மூட்டுகள் மற்றும் கிரானியோஃபேஷியல் பகுதியின் அசாதாரண மார்போஜெனீசிஸ்.தேசிய ஜெனட்.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
பெய்ராட்-ஜான்விட், எம். மற்றும் பலர்.GRHL3 இல் ஆதிக்கம் செலுத்தும் பிறழ்வுகள் வான் டெர் வார்ட் நோய்க்குறியை ஏற்படுத்துகின்றன மற்றும் வாய்வழி சுற்றோட்டத்தின் வளர்ச்சியை பாதிக்கின்றன.ஆம் ஜே ஹம் ஜெனட் 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
ஹாரிஸ், எம்ஜே மற்றும் ஜூரிலோஃப், டிஎம் ஆகியோர் நரம்புக் குழாய் மூடலில் குறைபாடுகள் உள்ள சுட்டி மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் பட்டியலைப் புதுப்பித்து, நரம்புக் குழாய் மூடல் பற்றிய முழுமையான மரபணு புரிதலை நோக்கி முன்னேறுகிறார்கள்.பிறப்பு குறைபாடுகள் பற்றிய ஆய்வு.பகுதி A, மருத்துவ மற்றும் மூலக்கூறு டெரட்டாலஜி 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-மத்தியஸ்த PDGFRalpha சமிக்ஞையானது p53-சார்ந்த உள்செல்லுலார் பாதை மூலம் எலும்பு வளர்ச்சியில் உயிர்வாழ்வதையும் பெருக்கத்தையும் ஒழுங்குபடுத்துகிறது.மரபணு வளர்ச்சி 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
கோப், ஏஜே, கிரீன், என்டி மற்றும் முர்டோக், ஜேஎன் டிஷெவெல்ட்: நரம்பியல் குழாய் மூடுதலுக்கு குவிந்த விரிவாக்கம்.நரம்பியல் போக்குகள்.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).